该协议描述了从微血管片段或MVF生成三维血管化和功能性产热脂肪。 目前用于工程产热脂肪组织的策略很复杂，不能完全描述其多细胞和功能特性。MVF是使血管化和脂肪组织形成的单一细胞来源。
作为一种简单的单一来源方法，可以创建米色脂肪的生物仿制品，MVF在促进肥胖和代谢疾病治疗的理解或开发方面具有巨大潜力。将用70%乙醇处理的适当剃光和安乐死的动物置于仰卧位，并开始分离腹股沟脂肪。用一把剪刀抬起阴茎下方的皮肤并进行切口，从中心开始横向切割，形成V形，然后循环到动物的背部以进入整个脂肪沉积物。
切割时，通过切割相互连接的筋膜组织来确保皮肤与脂肪分离。一旦筋膜被适当切割，确保两侧的腹股沟脂肪，从腹股沟延伸到背部，是可见的。接下来，在单独的锥形管中去除两侧的脂肪，该锥形管含有 10 毫升 PBS 中的 BSA，浓度为每毫升 1 毫克。
要收获附睾脂肪，请切开腹部皮肤，然后小心地切开睾丸周围的薄层。用镊子轻轻拉动脂肪组织，然后用剪刀剪掉，同时避免解剖任何主要的可见血管。现在，将去除的脂肪放入 50 毫升锥形管中，其中含有 10 毫升每毫升 1 毫克 BSA 的 PBS。
为了隔离后皮下脂肪，将老鼠俯卧转并用大剪刀将背部的厚皮一直剪到头皮，注意不要切得太深。切开连接皮肤和组织的筋膜。在分离皮下脂肪并将其放入含有 10 毫升每毫升 BSA 的 50 毫升锥形管中之前，将位于肩胛内区域的皮下脂肪与靠近脊柱的棕色脂肪区分开来。
在生物罩内工作时，使用镊子将切除的脂肪放入标准的 100 毫升培养皿中，培养皿中含有 0.5 毫升每毫升 1 毫克 BSA 的 PBS。从脂肪中去除任何可见的血管、肌肉或外来组织。用剪刀将脂肪切碎 10 分钟，并通过添加更多 BSA 来检查结块。
如有必要，继续切碎，然后用10毫升移液管将切碎的脂肪悬浮液转移到无菌250毫升烧瓶中。通过在PBS中添加足够的BSA，使烧瓶中的体积达到20毫升。现在将PBS中的BSA添加到胶原酶中，并通过轻轻摇动溶液来均质化溶液，然后通过0.22微米尼龙网过滤器将其无菌过滤。
立即将所需量的胶原酶溶液加入切碎的脂肪悬浮液中，并通过在37摄氏度的水浴中以圆周运动摇动烧瓶来消化脂肪。将消化的脂肪转移到标有消化脂肪或碎脂肪的50毫升锥形管中。将试管以 400 G 离心四分钟，将微血管碎片或 MVF 旋转成红色沉淀。
轻轻地将上清液倒入标记废物的50毫升锥形管中，而不会干扰沉淀。接下来，将10毫升每毫升BSA中的PBS中加入10毫升1毫克，并通过轻轻上下移液两次来混合沉淀悬浮液而不会破坏碎片。现在，将预先浸泡在无菌培养皿中的500微米屏幕，该培养皿含有PBS中每毫升BSA中的5毫升1毫克，并将其放在保存在新培养皿上的塑料筛网支架上。
将10毫升悬浮液从消化的颗粒管中移液到同心圆的屏幕上。在PBS中用每毫升1毫克BSA的额外五毫升洗涤过滤器并将其丢弃，同时将滤液保留在培养皿内。然后将预先浸泡的37微米屏幕放在新的培养皿上的塑料屏幕支架上方。
使用新鲜移液管，将滤液从第一次过滤中以同心圆转移到筛网上。如前所述，在PBS中用BSA清洗筛网，这次，丢弃滤液，同时保留37微米筛网。将 37 微米的屏幕滑入一个新的培养皿中，培养皿中含有 PBS 中每毫升 1 毫克 BSA 的 5 毫升。
通过将培养皿轻轻敲打在锥形支架上来移开碎片，不要溢出任何液体。用PBS中的另外五毫升BSA冲洗过滤器。接下来，将液体从培养皿转移到无菌的50毫升锥形管中。
再冲洗37微米的屏幕几次，将洗涤液加入锥形管中，直到收集的总体积为15至20毫升。最后一次冲洗后丢弃屏幕。用剪刀剪断 20 微升移液器吸头的末端。
轻轻摇动含有液体的试管，然后使用切开的移液器吸头抽取两个 20 微升的等分试样，并将每个等分试样移液到干净的 35 毫米培养皿中。使用标准光学显微镜计算每个培养皿中样品中的片段数，并使用手稿中提到的公式，获得分离的微血管片段总数。将剩余的液体在 50 毫升锥形管中以 400 G 旋转四分钟以收集 MVF。
旋转后，从锥形管中倒出大部分上清液，并使用移液管除去管边缘残留的少量液体。接下来，将凝血酶添加到指定用于灌制凝胶的孔中。切开 200 微升移液器吸头的末端，并使用它，轻轻地将 MVF 重悬于纤维蛋白原中，以获得所需的最终密度。
将悬浮液移入孔中的凝血酶溶液中，并通过上下移液快速均质混合物。灌制所有凝胶后，将孔板置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中约15分钟，以使凝胶交联。以BODIPY为脂质染色剂，通过水凝胶的共聚焦显微镜成像观察脂质和分化的脂肪细胞。
使用白色脂肪或米色脂肪培养基培养非血管化脂肪组织，分别由瘦和糖尿病啮齿动物衍生的MVF形成非血管化的白色或米色脂肪组织。同样，使用白色脂肪或米色脂肪培养基培养血管化脂肪组织导致啮齿动物来源的MVF分别形成血管化的白色或米色脂肪组织。 通过共聚焦显微镜也观察到从人类MVF获得的非血管化白色和米色脂肪组织。
使用RT-qPCR对MVF分化为米色脂肪组织的能力进行了遗传证实。 暴露于直接白色脂肪或米色脂肪培养基的瘦和糖尿病啮齿动物MVF评估了脂肪生成，产热和血管生成。正如预期的那样，解偶联蛋白1在米色脂肪组织中的表达显着更高。
在暴露于间接白色脂肪或米色脂肪培养基的啮齿动物MVF以及暴露于直接白色脂肪或米色致脂介质的人类MVF中也观察到了类似的趋势。最后，从线粒体生物能量学来看，很明显，在功能上，米色脂肪组织在所有情况下都具有较高的耗氧率或OCR水平。应优化脂肪组织的酶消化，以一致地再现相似大小和质量的MVF。
消化后，MVF应轻柔处理，特别注意避免片段进一步破碎。该技术有助于进一步平衡血管生长和脂肪细胞分化，证明这取决于引入的因素。
