이 프로토콜은 미세혈관 조각(MVF)에서 3차원 혈관화 및 기능적 열 발생 지방의 생성을 설명합니다. 열 발생 지방 조직을 엔지니어링하기 위한 현재 전략은 복잡하며 다세포 및 기능적 특성을 완전히 묘사하지 않습니다. MVF는 혈관 형성 및 지방 조직 형성을 가능하게 하는 단일 세포 공급원입니다.
베이지색 지방의 생물학적 모조품을 만드는 간단한 유일한 방법인 MVF는 비만 및 대사 질환 치료법의 이해 또는 개발을 촉진할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 적절하게 면도하고 안락사시킨 동물을 70 % 에탄올로 처리 한 앙와위 자세로 놓고 사타구니 지방의 분리를 시작합니다. 가위로 음경 아래의 피부를 들어 올리고 중앙에서 시작하여 옆으로 절단하여 V 자 모양을 형성 한 다음 동물의 뒤쪽으로 고리를 만들어 전체 지방 침전물에 접근합니다.
절단하는 동안 상호 연결된 근막 조직을 절단하여 지방에서 피부를 분리하십시오. 근막이 적절하게 절단되면 사타구니에서 뒤쪽으로 뻗어 있는 양쪽의 사타구니 지방이 보이는지 확인합니다. 다음으로, 밀리리터당 1밀리그램의 농도를 갖는 PBS 중 10밀리리터의 BSA를 함유하는 별도의 원뿔형 튜브에서 양면으로부터 지방을 제거한다.
부고환 지방을 채취하려면 복부 피부를 자른 다음 고환을 둘러싼 얇은 층을 조심스럽게 자릅니다. 집게를 사용하여 지방 조직을 부드럽게 당기고 가위를 사용하여 잘라내면서 눈에 보이는 주요 혈관의 절개를 피하십시오. 이제 제거된 지방을 PBS에서 밀리리터당 1밀리그램 BSA의 10밀리리터가 들어 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다.
후방 피하 지방을 분리하려면 쥐를 엎드려 큰 가위를 사용하여 등의 두꺼운 피부를 두피까지 자르고 피부 아래를 너무 깊게 자르지 않도록주의하십시오. 피부와 조직을 연결하는 근막을 자릅니다. 견갑골 내 부위에 위치한 피하 지방을 척추에 더 가까운 갈색 지방과 구별한 후 PBS에서 밀리리터당 1밀리그램 BSA 10밀리리터가 들어 있는 50밀리리터 원추형 튜브에 피하 지방을 분리하고 배치합니다.
바이오후드 내부에서 작업하는 동안 집게를 사용하여 절제된 지방을 PBS에서 밀리리터당 1밀리그램 BSA의 0.5밀리리터가 들어 있는 표준 100밀리리터 페트리 접시에 넣습니다. 지방에서 눈에 보이는 혈관, 근육 또는 외부 조직을 제거하십시오. 가위를 사용하여 10분 동안 지방을 다지고 BSA를 더 추가하여 덩어리가 있는지 확인합니다.
다진 지방 현탁액을 10 밀리리터 피펫으로 멸균 된 250 밀리리터 플라스크로 옮기기 전에 필요한 경우 계속 다진 것입니다. PBS에 충분한 BSA를 첨가하여 플라스크의 부피를 최대 20밀리리터로 만듭니다. 이제 PBS의 BSA를 콜라게나제에 첨가하고 0.22미크론 나일론 네트 필터를 통해 멸균된 여과하기 전에 부드럽게 흔들어 용액을 균질화합니다.
다진 지방 현탁액에 필요한 양의 콜라게나제 용액을 즉시 첨가하고, 섭씨 37 도의 수조에서 플라스크를 원형으로 흔들어 지방을 소화시킨다. 소화된 지방을 소화된 지방 또는 다진 지방이라고 표시된 50밀리리터 원추형 튜브에 옮깁니다. 튜브를 400G에서 4분 동안 원심분리하여 미세혈관 조각(MVF)을 빨간색 펠릿으로 회전시킵니다.
펠릿을 방해하지 않고 폐기물이라고 표시된 50밀리리터 원뿔형 튜브에 상층액을 부드럽게 디캔팅합니다. 다음으로, PBS 중 1밀리리터당 1밀리그램 BSA 10밀리리터를 펠릿이 들어 있는 튜브에 첨가하고, 파편을 파괴하지 않고 부드럽게 위아래로 두 번 피펫팅하여 펠릿 현탁액을 혼합합니다. 이제 PBS에서 밀리리터당 1밀리그램 BSA 5밀리리터가 들어 있는 멸균 페트리 접시에 미리 담근 500미크론 스크린을 새 페트리 접시에 보관된 플라스틱 스크린 홀더 위에 놓습니다.
소화된 펠릿 튜브에서 10밀리리터의 현탁액을 동심원으로 스크린에 피펫팅합니다. PBS에서 밀리리터 BSA당 1밀리그램의 추가 5밀리리터로 필터를 세척하고 여과액을 페트리 접시 내부에 유지하면서 폐기합니다. 그런 다음 미리 담근 37미크론 스크린을 새 페트리 접시의 플라스틱 스크린 홀더 위에 놓습니다.
새로운 피펫을 사용하여 첫 번째 여과액의 여과액을 동심원의 스크린으로 옮깁니다. 앞서 설명한 바와 같이, PBS에서 BSA로 스크린을 세척하고, 이번에는 37 마이크론 스크린을 유지하면서 여과액을 버린다. 37미크론 스크린을 PBS에서 밀리리터당 1밀리그램 BSA의 5밀리리터가 들어 있는 새 페트리 접시에 밀어 넣습니다.
액체를 흘리지 않고 원뿔형 홀더에 접시를 부드럽게 두드려 조각을 제거합니다. PBS에서 추가로 5밀리리터의 BSA로 필터를 헹굽니다. 다음으로, 페트리 접시에서 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브로 액체를 옮깁니다.
37 미크론 스크린을 여러 번 더 헹구고 수집 된 총 부피가 15-20 밀리리터가 될 때까지 원추형 튜브에 세척액을 추가합니다. 마지막 헹굼 후 스크린을 버리십시오. 가위를 사용하여 20마이크로리터 피펫 팁의 끝을 자릅니다.
절단된 피펫 팁을 사용하여 20마이크로리터의 분취액 2개를 추출하기 전에 액체가 들어 있는 튜브를 부드럽게 흔들고 각 분취량을 깨끗한 35mm 페트리 접시에 피펫팅합니다. 표준 광학 현미경을 사용하여 각 페트리 접시의 샘플에서 단편 수를 세고 원고에 언급된 공식을 사용하여 분리된 미세혈관 단편의 총 수를 얻습니다. 400G에서 50밀리리터 원뿔형 튜브에 남아 있는 액체를 4분 동안 회전시켜 MVF를 수집합니다.
회전 후 원추형 튜브에서 대부분의 상청액을 디캔팅하고 피펫을 사용하여 튜브 가장자리에 남아 있는 소량의 액체를 제거합니다. 다음으로, 젤 주조를 위해 지정된 우물에 트롬빈을 첨가하십시오. 200마이크로리터 피펫 팁의 끝을 잘라낸 후 MVF를 피브리노겐에 부드럽게 재현탁하여 원하는 최종 밀도를 얻습니다.
현탁액을 웰에 있는 트롬빈 용액으로 피펫팅하고, 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 신속하게 균질화한다. 모든 겔이 캐스팅되면 웰 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소의 인큐베이터에 약 15분 동안 넣어 겔 가교를 허용합니다. 지질과 분화된 지방세포는 BODIPY를 지질 염색으로 사용하여 하이드로젤의 공초점 현미경 이미징으로 관찰되었습니다.
백색 지방생성 또는 베이지색 지방생성 배지를 사용하여 비혈관화 지방화 지방조직을 배양한 결과, 마른 조직과 당뇨병성 설치류 유래 MVF 모두에서 각각 비혈관화된 백색 또는 베이지색 지방조직이 형성되었습니다. 유사하게, 백색 지방생성 또는 베이지색 지방생성 배지를 사용하여 혈관화된 지방 조직의 배양은 설치류-유래된 MVF로부터 각각 혈관화된 백색 또는 베이지색 지방 조직의 형성을 초래하였다. 인간 MVF로부터 얻어진 비-혈관화된 백색 및 베이지색 지방 조직도 공초점 현미경에 의해 관찰되었다.
베이지색 지방 조직으로 분화하는 MVF의 능력은 RT-qPCR을 사용하여 유전적으로 확인되었습니다. 직접적인 백색 지방생성 또는 베이지색 지방생성 배지에 노출된 살코기 및 당뇨병성 설치류 MVF는 지방 생성, 열 발생 및 혈관 신생에 대해 평가되었습니다. 예상대로 분리된 단백질 1의 발현은 베이지색 지방형성 조직에서 유의하게 더 높았다.
간접 백색 지방생성 또는 베이지색 지방생성 배지에 노출된 설치류 MVF와 직접적인 백색 지방생성 또는 베이지색 지방생성 배지에 노출된 인간 MVF에서도 유사한 경향이 관찰되었습니다. 마지막으로, 미토콘드리아 생물 에너지학에서 기능적으로 베이지색 지방 조직은 모든 경우에 특징적으로 더 높은 산소 소비율(OCR) 수준을 갖는 것이 분명했습니다. 지방 조직의 효소 분해는 유사한 크기와 품질의 MVF를 일관되게 재현하도록 최적화되어야 합니다.
소화 후 MVF는 파편이 더 이상 분해되지 않도록 특별한 주의를 기울여 부드럽게 다루어야 합니다. 이 기술은 도입된 요인에 의존하는 것으로 입증된 혈관 성장과 지방 세포 분화의 균형을 더욱 촉진하는 데 도움이 되었습니다.
