הפרוטוקול מאפשר הערכה מוטציה במיקרואורגניזמים. זה יכול להדגים כיצד אורגניזמים בהקשר סביבתי משפיעים על ההסתברות למוטציה ספונטנית. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שזה זול ויעיל.
הערכות רבות של שיעור המוטציה יכולות להתבצע במקביל. מוטציות שאמצעי פרוטוקול זה יכול לעקוב אחר עמידות לאנטיביוטיקה. אז פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את אחד האתגרים הגדולים בעולם, התנגדות מיקרוביאלית.
שיטה זו יכולה לספק תובנה כיצד התאים בהקשר האקולוגי יכולים להשפיע על האבולוציה של עמידות מיקרוביאלית. פרוטוקול זה מעריך את שיעורי המוטציה במונוקולטורה של זן המעבדה, אך יישמו אותו על זנים קליניים ותרבות-שותף של שני זנים כדי להבחין בין מולקולה ביו-ניוטרלית. התגובות המסוכנות ביותר המשמשות בפרוטוקול זה הן ריפאמפיץ אנטיביוטי ומתנול.
אז הקפד להשתמש כפפות מגן ומ המשקפיים כאשר ריפאמפיץ מומס מתנול. כדי להתחיל בהליך זה לחסן שלושה מ"ל של מרק לייסוגן נוזלי עם שריטה של קרח מן המניה E.coli K12 גליצרול. לנער את תרבות LB ב 120 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך כשבע שעות.
לאחר מכן, לדלל את התרבות 2000-לקפל עם תמיסת מלח. הוסף 10 מ"ל של נוזל דייוויס בינוני מינימלי לכל צינור עם כל מכיל ריכוז שונה של גלוקוז כפי שמוצג כאן. הוסף 100 microliters של התרבות מדוללת לשלושה צינורות פולימר תחתית חרוטית כובע מסך 50 מ"ל.
הכינו 22 מ"ל של חמישה פתרונות שונים של מדיום דייוויס נוזלי מינימלי עם גלוקוז, כל אחד בצינור 50 מ"ל משלו כמתאר בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין אינוקולה לסביבות, למדוד תחילה את הצפיפות האופטית של תרבויות הלילה ב 600 ננומטר. לדלל את התרבויות עם תמיסת מלח ולהוסיף בין 2200 ו 110000 תאים לכל סביבה.
פעולה זו תבטיח כי inoculum עבור mL אחד של הסביבה מכיל בין 1000 ו 5000 תאים. לאחר מכן, ליצור פריסה אקראית של תרבויות מקבילות עבור 196 צלחת באר עמוקה. העבר מ"ל אחד של המדיה מחוסן לתוך כל באר של הצלחת על פי הפריסה.
לאחר מכן, לתקן את המכסה של הצלחת עם קלטת ולשקול את הצלחת כולה עם המכסה ואת הקלטת. לנער את הצלחת ב 250 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, מניחים שני L של מים מזוקקים באינקובטור כדי לייצב את כמות האידוי בין הסטים הניסיוניים.
לקבוע את גודל inoculum על ידי ציפוי 10 microliters של כל מדיה מחוסן על צלחת ת"א אגר לא סלקטיבית. השתמש במפזר סטרילי בצורת L עד שמשטח הגר יבש. לאחר מכן, להכין אגר ת"א סלקטיבי המכיל ריפאמפיץ בשש צלחות היטב.
פיפטה חמש מ"ל של אגר ת"א סלקטיבי לתוך כל באר של שש צלחות באר. לספור את המושבה להרכיב יחידות על לוחות אגר שאינם סלקטיביים, ולקבוע את גודל אינוקולה. לאחר 24 שעות של דגירה, לשקול את צלחת באר עמוקה כולה כדי לקבוע את כמות האידוי, אשר ככל הנראה סביב 10% להעביר שלוש תרבויות שנבחרו באופן אקראי לכל בדיקה לתוך צינורות microcentrifuge שכותרתו.
צלחת הנותרים 81 תרבויות מקבילות מן צלחת באר עמוקה על אגר ת"א סלקטיבי המכיל ריפאמפיץ. לאחר מכן, להסיר את המכסים מן צלחות אגר סלקטיבי ולהשאיר אותם חשופים בתנאים סטריליים לייבש את כל הנוזל על פני השטח של אגר. לקבוע את מספר המושבה להרכיב יחידות על ידי דילול התרבויות מן צינורות microcentrifuge באמצעות חמישה 10 פעמים צעדי דילול על ידי ערבוב ומערבולת 900 microliters של תמיסת מלוחים עם 100 microliters של התרבות לכל צעד דילול.
צלחת 40 microliters של הדילול הסופי על אגר ת"א לא סלקטיבי מניחים את המכסה על הצלחות. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר כל בארות על צלחת שש באר הם ללא נוזל התרבות, למקם את המכסה בחזרה על.
ואז להדגר את הצלחות עם המכסה על ב 37 מעלות צלזיוס במשך 44-48 שעות. ביום הרביעי, לספור את המושבה להרכיב יחידות על לוחות אגר לא סלקטיביים. ביום החמישי, לספור את מספר המושבות עמידים לאנטיביוטיקה על צלחות אגר ת"א סלקטיבי.
רשום את ההתפלגות בין תרבויות מקבילות של מספר המוטנטים שנצפו לצורך בחינה מסוימת. פתח את התוכנה המתאימה במחשב. בכרטיסיה בדיקת השערות, השאר את הערכים בברירת המחדל שלהם.
לחץ על עיון ובחר את קובץ הטקסט עם התפלגות המוטנטים שנצפו. לאחר העלאת הקובץ, לחץ על בדיקה שבוצעה. בצד ימין, תחת תוצאת הבדיקה, תחת מדגם אחד ML-מבחן, למצוא את מספר המוטציה.
זה m, המספר הצפוי של אירועים מוטציה. לאחר מכן, העריך את שיעור המוטציה של גנוטיפ מסוים בסביבה מסוימת כחלוקה לרמות בפרוטוקול הטקסט. שיעורי המוטציה MG1655 של שלושה סמנים פנוטיפיים שונים, ציקלוזרין, ריפאמפיצין וחומצה נלידיקסית מוצגים כאן.
שיעורי המוטציה מוערכים בדיוויס בינוני מינימלי עם ריכוז גלוקוז של 80 מ"ג / ליטר, 125 מ"ג / ליטר, ו 250 מ"ג / ליטר. במקרה אחד, ריכוז גלוקוז של 1000 מ"ג / ליטר משמש. כצפוי, שיעורי המוטציה גבוהים יותר עבור עמידות ציקלוגרינית, הנמוך ביותר עבור עמידות חומצה nalidixic, ואת קצב ההתנגדות ריפאמפיצין הוא באמצע.
התנודות מראות בבירור איזה זן הוא מוטטור מכופתר ויש לו שיעורי מוטציה נורמליים. כמו זן מחיקת המוט היה שיעור מוטציה עמידות חומצה nalidixic כי הוא כ 50x גבוה יותר מאשר זן MG1655 שליטה. בעת עיצוב מראש של פרוטוקול זה, ודא שהתאים שלך גדלים היטב.
הם צריכים לגדול לצפיפות אחידה על פני תרבויות מקבילות עם אותה סביבה. מעקב אחד להליך זה הוא לקבוע את רצף ה- DNA של גן rpoB במושבות עמידות. כדי לקבוע כיצד הספקטרום של מוטציות להתנגדות ריפאמפיץ משתנה עם גנוטיפ מיקרוביאלי סביבתי.
התנודות במאה ה-20 הדגימו כיצד מוטציה היא ספונטנית ואקראית ביחס לסביבה. עכשיו, הם שופך אור חדש על איך שיעורי מוטציה משתנים עם הסביבה מבחינה גנטית, אקולוגית, אפילו חברתית.
