הפרוטוקול מתאר את הבידוד של IMS ריאתי והעברה מאומצת לאחר קביעת IL-33 במודל עכבר, אשר יכול להקל על מחקר in vivo של פיברוזיס ריאתי אידיופתי. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לחקור את תפקודם של המקרופאגים, המדמים ציטוקינים מסורתיים בפיתוח IPF. כדי להתחיל, להוציא את בקבוקון של ליפוזומים clodronate מהמקרר.
תנו לו להתחמם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר והפכו מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב אחיד. שאפו 60 מיקרוליטר של ליפוזומים קלודרונט באמצעות פיפטה עם קצה יניקה סטרילי. לנהל את הבקרה ואת התרופה טיפה חכם לתוך חלל האף של העכבר מורדם.
לאחר כל טיפה, ודא שהעכבר שואף את התרופה לחלוטין ונושם באופן שווה. לאחר דלדול המקרופאגים בנאדיות בעכבר המקבל, התחל על ידי חיטוי העור של העכבר המארח מורדם עם 75% אלכוהול ויוד. השתמש מספריים לחתוך דרך העור ולחשוף את רקמת cardiopulmonary.
שואפים 10 מיליליטר של PBS במזרק מצויד מחט 20 מד, ולהכניס את קצה המחט לתוך אטריום ימין של העכבר. לאחר מכן לחתוך את נבוב הווריד הנחות של העכבר עם מספריים כירורגיים ידנית לבלבל את העכבר עם PBS במהירות קבועה של 10 עד 20 מיליליטר לדקה עד רקמת הריאה הופך לבן. יתר על כן, הבלו את רקמת הריאה ולהעביר אותו PBS קר כקרח בצלחת תרבית.
חותכים את רקמת הריאה לשברים ומוסיפים 15 מיליליטר של מדיום DMEM המכיל 1% collagenase A כדי לבודד את המקרופאגים, ואז לדגור אותו ב 100 סל"ד במשך 30 דקות על שולחן רעד 37 מעלות צלזיוס. שאפו את מתלה רקמת הריאה בערך 20 פעמים דרך מזרק 10 מיליליטר כדי לעשות את זה בסדר. סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
צנטריפוגה את התסנין ב 400 גרם במשך 10 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, ליז את הדם האדום עם שלושה מיליליטר של חיץ ליזה התאית על קרח במשך שתיים עד שלוש דקות. צנטריפוגה ב 150 גרם במשך חמש דקות להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מיליליטר של DMEM.
לאחר מכן לספור את התאים באמצעות hemocytometer. זרעו את התאים לצלחת תרבית תאים דבקה בקוטר 10 ס"מ ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% כדי להצמיד את המקרופאגים הבין-תאיים של הריאה לכלים. לאחר שעה, שאפו את התאים העליונים והצפים.
מוסיפים 10 מיליליטר של מדיום התרבית הטרי והשלם ודוגרים במשך יותר משמונה שעות או לילה. כדי לעורר את המקרופאגים הבין-תאיתיים המבודדים, החלף את מדיום התרבית המשומש באינטרלוקינים בינוניים שלמים 33. כמו כן להכין צלחת בקרה על ידי הוספת PBS במקום interleukins 33.
לדגור על הצלחות במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כדי לנתק את המקרופאגים interstitial ריאתי, לטפל בהם עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין במשך חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים שלושה מיליליטר של תרבית טרייה מדיום שלם כדי להרוות את העיכול וצנטריפוגה את תרחיף התא כדי לקצור את המקרופאגים הריאתיים.
לאחר ספירת התאים, יש להשהות מחדש את התאים ב-PBS לריכוז סופי של חמש פעמים 10 לתאים החמישיים ל-50 מיקרוליטר. כדי להתחיל את ההעברה של מקרופאגים interstitial, לתקן את הגפיים של העכבר מקבל מורדם על צלחת אנכית עם סרט רפואי בעדינות למשוך את הלשון של העכבר לצד אחד, באמצעות צמר גפן. לאחר הפעלת מנורת האינטובציה, להאיר אותו על הגרון של העכבר כדי לראות את קנה הנשימה, אשר צריך להיות קרוב לבסיס הלשון.
הכנס את צינורית מחט הבית לקנה הנשימה באמצעות מנורת אינטובציה 22 מד וחוט מנחה בקוטר 0.4 מילימטר. כדי לסיים את האינטובציה, להסיר את חוט המדריך ולדחוף את הצינורית לתוך קנה הנשימה של העכבר. כעת הזריקו 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לעכבר המקבל דרך קנה הנשימה כאשר הצינורית נראית נכנסת לקנה הנשימה.
לאחר 24 שעות, מתן בלומיצין דרך קנה הנשימה כדי לגרום לפיברוזיס ריאתי אידיופתי. כמו כן לתת נפח שווה של מלוחים לקבוצת הביקורת. לאחר 21 יום, לקבוע את מידת החומרה של פיברוזיס ריאתי על ידי הערכת הביטוי של סמנים עבור פיברוזיס ואת ציוני Ashcroft.
צביעת HE הראתה כי העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי אינטרלוקין 33 החמירה את מידת הרס רקמת הריאה והגדילה את צבירת הפיברובלסטים בעכברים שעוררו בלומיצין, בהשוואה לקבוצת הביקורת. העלייה בציון אשקרופט ממחישה גם את מידת הפיברוזיס הריאתי. רמות הביטוי של mRNA של אלפא SMA ופיברונקטין ברקמות הריאה של העכבר המקבל שהכילו אינטרלוקינים שהועברו באימוץ מקרופאגים אינטרסטיציאליים 33 וטופלו בבלומיצין היו גבוהות יותר, בהשוואה לאלה של עכברי הבר שטופלו ב-BLM.
500 מיקרוליטר אוויר צריך להיות נכנס מיד לתוך הריאות עם מזרק 1 מילימטר כדי להבטיח כי השעיית התא בצינורית יכול להיכנס לחלוטין לרקמת הריאה.
