이 프로토콜은 특발성 폐 섬유증의 생체 내 연구를 용이하게 할 수 있는 마우스 모델에서 IL-33 결정 후 폐 IMS의 분리 및 입양 전달을 설명합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 IPF 개발에서 전통적인 사이토카인에 의해 시뮬레이션된 대식세포의 기능을 탐색할 수 있습니다. 시작하려면 냉장고에서 클로드로네이트 리포솜 바이알을 꺼냅니다.
실온에서 30분 동안 데우고 균일한 혼합을 위해 여러 번 뒤집습니다. 멸균 흡입 팁이 있는 피펫을 사용하여 60마이크로리터의 클로드로네이트 리포솜을 흡인합니다. 대조군 및 약물을 마취된 마우스의 비강 내로 적하하여 투여한다.
한 방울 떨어 뜨린 후 마우스가 약물을 완전히 흡입하고 고르게 호흡하는지 확인하십시오. 수용자 마우스에서 폐포 대식세포가 고갈된 후 마취된 숙주 마우스의 피부를 75% 알코올과 요오드로 소독하는 것으로 시작합니다. 가위를 사용하여 피부를 자르고 심폐 조직을 노출시킵니다.
20게이지 바늘이 장착된 주사기에서 PBS 10ml를 흡인하고 바늘 끝을 마우스의 우심방에 삽입합니다. 그런 다음 수술 용 가위로 마우스의 하대정맥을 절단하고 폐 조직이 흰색으로 변할 때까지 분당 10-20 밀리리터의 일정한 속도로 PBS로 마우스를 수동으로 관류합니다. 또한, 폐 조직을 절제하고 배양 접시에 담아 얼음처럼 차가운 PBS로 옮긴다.
폐 조직을 조각으로 자르고 1%콜라게나제 A를 함유한 DMEM 배지 15밀리리터를 첨가하여 대식세포를 분리한 다음 섭씨 37도의 진탕 테이블에서 100RPM으로 30분 동안 배양합니다. 폐 조직 현탁액을 10밀리리터 주사기를 통해 약 20회 흡인하여 미세하게 만듭니다. 40 마이크로 미터 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 여과합니다.
여과액을 400G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버린 후, 적혈구를 3 밀리리터의 세포 용해 완충액으로 얼음 위에서 2 내지 3 분 동안 용해시킨다. 150G에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 10밀리리터의 DMEM에 재현탁합니다.
그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 세포를 10cm 부착 세포 배양 접시에 파종하고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 1시간 동안 배양하여 폐 간질 대식세포를 접시에 부착합니다. 1시간 후, 상층액과 부유 세포를 흡인한다.
신선하고 완전한 배양 배지 10 밀리리터를 넣고 8 시간 이상 또는 밤새 배양하십시오. 분리된 간질성 대식세포를 자극하기 위해, 사용된 배양 배지를 완전한 배지 인터루킨으로 교체한다 33. 또한 인터루킨 대신 PBS를 첨가하여 대조군을 준비한다 33.
플레이트를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다. 폐 간질 대 식세포를 해리하려면 1 밀리리터의 0.25 % 트립신으로 5 분 동안 치료하십시오. 그런 다음 3 밀리리터의 신선한 배양 완전 배지를 첨가하여 소화를 촉진하고 세포 현탁액을 원심 분리하여 폐 대 식세포를 수확합니다.
세포를 계수한 후, 세포를 PBS에 5배 내지 50 마이크로리터당 5번째 세포의 최종 농도로 재현탁한다. 간질 대 식세포의 이식을 시작하려면 마취 된 수용자 마우스의 팔다리를 의료용 테이프로 수직 플레이트에 고정하고 면봉을 사용하여 마우스의 혀를 한쪽으로 부드럽게 당깁니다. 삽관 램프를 켠 후 마우스의 목구멍에 비추어 혀의 기저부에 가까워야하는 기관을보십시오.
22게이지 삽관 램프와 0.4mm 직경의 가이드선을 사용하여 유치 바늘 캐뉼라를 기관에 삽입합니다. 삽관을 마치려면 가이드 와이어를 제거하고 캐뉼라를 마우스 기관에 밀어 넣습니다. 이제 캐뉼라가 기관으로 들어가는 것이 보일 때 기관을 통해 수용자 마우스에 50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 주입합니다.
24시간 후, 기관을 통해 블레오마이신을 투여하여 특발성 폐 섬유증을 유도합니다. 또한 대조군에 동일한 양의 식염수를 투여하십시오. 21일 후, 섬유증에 대한 마커의 발현을 평가하여 폐섬유증의 중증도 정도를 결정하고 Ashcroft 점수를 측정한다.
HE 염색은 인터루킨 33 자극 대식세포의 입양 전달이 대조군에 비해 블레오마이신 자극 마우스에서 폐 조직 파괴 정도를 악화시키고 섬유아세포 응집을 증가시키는 것으로 나타났습니다. Ashcroft 점수의 증가는 또한 폐 섬유증의 정도를 보여줍니다. 입양 이식된 인터루킨 33 자극 간질 대식세포를 함유하고 블레오마이신으로 처리된 수용자 마우스의 폐 조직에서 알파 SMA 및 피브로넥틴의 mRNA 발현 수준은 BLM 처리된 야생형 마우스에 비해 더 높았다.
캐뉼라의 세포 현탁액이 폐 조직에 완전히 들어갈 수 있도록 1mm 주사기로 500 마이크로 리터의 공기를 즉시 폐에 넣어야합니다.
