Le protocole décrit l’isolement de l’IMS pulmonaire et le transfert adoptif après détermination de l’IL-33 dans un modèle murin, ce qui peut faciliter l’étude in vivo de la fibrose pulmonaire idiopathique. La technique permet aux chercheurs d’explorer la fonction des macrophages, simulée par les cytokines traditionnelles dans le développement de la FPI. Pour commencer, sortez le flacon de liposomes de clodronate du réfrigérateur.
Laisser chauffer pendant 30 minutes à température ambiante et le retourner plusieurs fois pour assurer un mélange uniforme. Aspirer 60 microlitres de liposomes clodronate à l’aide d’une pipette avec un embout d’aspiration stérile. Administrer le témoin et le médicament goutte à goutte dans la cavité nasale de la souris anesthésiée.
Après chaque goutte, assurez-vous que la souris inhale complètement le médicament et respire uniformément. Après l’épuisement des macrophages alvéolaires chez la souris receveuse, commencez par désinfecter la peau de la souris hôte anesthésiée avec 75% d’alcool et d’iode. Utilisez des ciseaux pour couper à travers la peau et exposer le tissu cardiopulmonaire.
Aspirez 10 millilitres de PBS dans une seringue équipée d’une aiguille de calibre 20 et insérez l’extrémité de l’aiguille dans l’oreillette droite de la souris. Ensuite, coupez la veine cave inférieure de la souris avec des ciseaux chirurgicaux et perfuser manuellement la souris avec du PBS à une vitesse constante de 10 à 20 millilitres par minute jusqu’à ce que le tissu pulmonaire devienne blanc. En outre, excisez le tissu pulmonaire et transférez-le dans du PBS glacé dans un plat de culture.
Coupez le tissu pulmonaire en fragments et ajoutez 15 millilitres de milieu DMEM contenant 1% de collagénase A pour isoler les macrophages, puis incuber à 100 RPM pendant 30 minutes sur une table à agiter à 37 degrés Celsius. Aspirez la suspension de tissu pulmonaire environ 20 fois à travers une seringue de 10 millilitres pour la rendre fine. Filtrer la suspension à travers une crépine à cellules de 40 micromètres.
Centrifuger le filtrat à 400 G pendant 10 minutes. Après avoir jeté le surnageant, lyser le sang rouge avec trois millilitres de tampon de lyse cellulaire sur de la glace pendant deux à trois minutes. Centrifuger à 150 G pendant cinq minutes et remettre en suspension la pastille de cellule dans 10 millilitres de DMEM.
Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensemencez les cellules dans une boîte de culture cellulaire adhérente de 10 centimètres et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour adhérer les macrophages interstitiels pulmonaires aux plats. Après une heure, aspirez le surnageant et les cellules flottantes.
Ajouter 10 millilitres du milieu de culture frais et complet et incuber pendant plus de huit heures ou toute la nuit. Pour stimuler les macrophages interstitiels isolés, remplacer le milieu de culture usé par un milieu complet d’interleukines 33. Préparez également une plaque de contrôle en ajoutant du PBS au lieu d’interleukines 33.
Incuber les plaques pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour dissocier les macrophages interstitiels pulmonaires, traitez-les avec un millilitre de trypsine à 0,25% pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite trois millilitres de milieu complet de culture fraîche pour étancher la digestion et centrifuger la suspension cellulaire pour récolter les macrophages pulmonaires.
Après avoir compté les cellules, remettre en suspension les cellules dans le PBS à une concentration finale de cinq fois 10 à la cinquième cellule par 50 microlitres. Pour commencer le transfert des macrophages interstitiels, fixez les membres de la souris receveuse anesthésiée sur une plaque verticale avec du ruban médical et tirez doucement la langue de la souris d’un côté, à l’aide d’un coton-tige. Après avoir allumé la lampe d’intubation, faites-la briller sur la gorge de la souris pour voir la trachée, qui doit être proche de la base de la langue.
Insérez la canule à aiguille à demeure dans la trachée à l’aide de la lampe d’intubation de calibre 22 et du fil guide de 0,4 millimètre de diamètre. Pour terminer l’intubation, retirez le fil guide et poussez la canule dans la trachée de souris. Maintenant, injectez 50 microlitres de la suspension cellulaire dans la souris receveuse à travers la trachée lorsque la canule pénètre dans la trachée.
Après 24 heures, administrer la bléomycine par la trachée pour induire une fibrose pulmonaire idiopathique. Administrez également un volume égal de solution saline au groupe témoin. Après 21 jours, déterminer le degré de gravité de la fibrose pulmonaire en évaluant l’expression des marqueurs de la fibrose et les scores d’Ashcroft.
La coloration HE a montré que le transfert adoptif d’interleukines 33 stimulait les macrophages exacerbait le degré de destruction du tissu pulmonaire et augmentait l’agrégation des fibroblastes chez les souris stimulées par la bléomycine, par rapport au contrôle. L’augmentation du score d’Ashcroft illustre également le degré de fibrose pulmonaire. Les niveaux d’expression de l’ARNm de l’alpha SMA et de la fibronectine dans les tissus pulmonaires de la souris receveuse contenant des macrophages interstitiels stimulés par des interleukines 33 transférés par adoption et traités à la bléomycine étaient plus élevés que ceux des souris de type sauvage traitées par BLM.
500 microlitres d’air doivent être immédiatement introduits dans les poumons avec une seringue d’un millimètre pour s’assurer que la suspension cellulaire dans la canule peut pénétrer complètement dans le tissu pulmonaire.
