Il protocollo descrive l'isolamento dell'IMS polmonare e il trasferimento adottivo dopo la determinazione di IL-33 in un modello murino, che può facilitare lo studio in vivo della fibrosi polmonare idiopatica. La tecnica consente ai ricercatori di esplorare la funzione dei macrofagi, simulata dalle citochine tradizionali nello sviluppo dell'IPF. Per iniziare, estrarre la fiala di liposomi clodronati dal frigorifero.
Lasciare scaldare per 30 minuti a temperatura ambiente e capovolgere più volte per garantire una miscelazione uniforme. Aspirare 60 microlitri di liposomi clodronati utilizzando una pipetta con una punta di aspirazione sterile. Somministrare il controllo e il farmaco goccia nella cavità nasale del topo anestetizzato.
Dopo ogni goccia, assicurarsi che il topo inali completamente il farmaco e respiri in modo uniforme. Dopo l'esaurimento dei macrofagi alveolari nel topo ricevente, iniziare disinfettando la pelle del topo ospite anestetizzato con alcol e iodio al 75%. Usa le forbici per tagliare la pelle ed esporre il tessuto cardiopolmonare.
Aspirare 10 millilitri di PBS in una siringa dotata di un ago da 20 gauge e inserire la punta dell'ago nell'atrio destro del mouse. Quindi tagliare la vena cava inferiore del topo con le forbici chirurgiche e perfondere manualmente il topo con PBS a una velocità costante di 10-20 millilitri al minuto fino a quando il tessuto polmonare diventa bianco. Inoltre, asportare il tessuto polmonare e trasferirlo in PBS ghiacciato in un piatto di coltura.
Tagliare il tessuto polmonare in frammenti e aggiungere 15 millilitri di mezzo DMEM contenente l'1% di collagenasi A per isolare i macrofagi, quindi incubarlo a 100 RPM per 30 minuti su un tavolo vibrante a 37 gradi Celsius. Aspirare la sospensione del tessuto polmonare circa 20 volte attraverso una siringa da 10 millilitri per farlo bene. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri.
Centrifugare il filtrato a 400 G per 10 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, lisare il sangue rosso con tre millilitri di tampone di lisi cellulare sul ghiaccio per due o tre minuti. Centrifugare a 150 g per cinque minuti e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di DMEM.
Quindi contare le cellule usando un emocitometro. Seminare le cellule in un piatto di coltura cellulare aderente di 10 centimetri e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per far aderire i macrofagi interstiziali polmonari ai piatti. Dopo un'ora, aspirare il surnatante e le cellule galleggianti.
Aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura fresco e completo e incubare per oltre otto ore o durante la notte. Per stimolare i macrofagi interstiziali isolati, sostituire il terreno di coltura esaurito con un mezzo completo interleuchine 33. Preparare anche una piastra di controllo aggiungendo PBS invece di interleuchine 33.
Incubare le piastre per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per dissociare i macrofagi interstiziali polmonari, trattarli con un millilitro di tripsina allo 0,25% per cinque minuti. Quindi aggiungere tre millilitri di terreno completo di coltura fresca per dissetare la digestione e centrifugare la sospensione cellulare per raccogliere i macrofagi polmonari.
Dopo aver contato le cellule, risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione finale di cinque volte 10 alle quinte cellule per 50 microlitri. Per iniziare il trasferimento dei macrofagi interstiziali, fissare gli arti del topo ricevente anestetizzato su una piastra verticale con nastro medico e tirare delicatamente la lingua del topo da un lato, usando un batuffolo di cotone. Dopo aver acceso la lampada di intubazione, illuminarla sulla gola del topo per vedere la trachea, che dovrebbe essere vicina alla base della lingua.
Inserire la cannula dell'ago di permanenza nella trachea utilizzando la lampada per intubazione calibro 22 e il filo guida del diametro di 0,4 millimetri. Per terminare l'intubazione, rimuovere il filo guida e spingere la cannula nella trachea del topo. Ora iniettare 50 microlitri della sospensione cellulare nel topo ricevente attraverso la trachea quando si vede la cannula entrare nella trachea.
Dopo 24 ore, somministrare bleomicina attraverso la trachea per indurre la fibrosi polmonare idiopatica. Somministrare anche un volume uguale di soluzione salina al gruppo di controllo. Dopo 21 giorni, determinare il grado di gravità della fibrosi polmonare valutando l'espressione dei marcatori per la fibrosi e i punteggi di Ashcroft.
La colorazione HE ha mostrato che il trasferimento adottivo di interleuchine 33 ha stimolato i macrofagi ha esacerbato il grado di distruzione del tessuto polmonare e aumentato l'aggregazione dei fibroblasti nei topi stimolati dalla bleomicina, rispetto al controllo. L'aumento del punteggio di Ashcroft illustra anche il grado di fibrosi polmonare. I livelli di espressione di mRNA di alfa SMA e fibronectina nei tessuti polmonari del topo ricevente contenenti macrofagi interstiziali stimolati da interleuchine 33 trasferite in modo adottivo e trattati con bleomicina erano più alti, rispetto a quelli dei topi wild-type trattati con BLM.
500 microlitri di aria devono essere immediatamente inseriti nei polmoni con una siringa da un millimetro per garantire che la sospensione cellulare nella cannula possa entrare completamente nel tessuto polmonare.
