IL-33刺激マクロファージのブレオマイシン誘導マウスモデルへの養子導入によるin vivo特発性肺線維症への影響の研究(英語)

このプロトコルは、特発性肺線維症のin vivo研究を容易にすることができるマウスモデルにおけるIL-33決定後の肺IMSの単離および養子移入を記載している。この技術により、研究者はIPFの発生における従来のサイトカインによってシミュレートされたマクロファージの機能を探索することができます。はじめに、冷蔵庫からクロドロネートリポソームのバイアルを取り出します。

室温で30分間温め、数回反転させて均一な混合を確保します。滅菌吸引チップを有するピペットを用いて60マイクロリットルのクロドロネートリポソームを吸引する。コントロールおよび薬物を麻酔をかけたマウスの鼻腔内に滴下して投与する。

各滴の後、マウスが薬を完全に吸い込み、均等に呼吸することを確認してください。レシピエントマウスの肺胞マクロファージが枯渇した後、麻酔をかけた宿主マウスの皮膚を75%アルコールとヨウ素で消毒することから始めます。はさみを使用して皮膚を切り裂き、心肺組織を露出させます。

20ゲージの針を備えた注射器に10ミリリットルのPBSを吸引し、針の先端をマウスの右心房に挿入します。次に、外科用ハサミでマウスの下大静脈を切断し、肺組織が白くなるまで毎分10〜20ミリリットルの一定速度でマウスにPBSを手動で灌流します。さらに、肺組織を切除し、培養皿内の氷冷PBSに移します。

肺組織を断片に切断し、1%コラゲナーゼAを含む15ミリリットルのDMEM培地を加えてマクロファージを分離し、摂氏37度の振とう台で100 RPMで30分間インキュベートします。肺組織懸濁液を20ミリリットルの注射器で約10回吸引して細かくします。懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーでろ過します。

ろ液を400Gで10分間遠心分離します。上清を捨てた後、赤血球を3ミリリットルの細胞溶解バッファーで氷上で2〜3分間溶解します。150 Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを10ミリリットルのDMEMに再懸濁します。

次に、血球計算盤を使用して細胞を数えます。細胞を10センチメートルの付着細胞培養皿に播種し、摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間インキュベートして、肺間質マクロファージを皿に接着させます。1時間後、上清および浮遊細胞を吸引する。

10ミリリットルの新鮮で完全な培地を加え、8時間以上または一晩インキュベートします。単離された間質マクロファージを刺激するために、使用済み培養培地をインターロイキン33の完全培地と交換する。また、インターロイキン33の代わりにPBSを添加してコントロールプレートを作製する。

プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。肺間質マクロファージを解離するには、1ミリリットルの0.25%トリプシンで5分間処理します。次に、3ミリリットルの新鮮な培養完全培地を加えて消化を消し、細胞懸濁液を遠心分離して肺マクロファージを回収します。

細胞を計数した後、細胞をPBSに再懸濁し、10〜50マイクロリットルの細胞当たり5倍の最終濃度となるようにする。間質性マクロファージの移動を開始するには、麻酔をかけたレシピエントマウスの手足を医療用テープで垂直プレートに固定し、綿棒を使用してマウスの舌を片側にそっと引っ張ります。挿管ランプをオンにした後、マウスの喉に当てて、舌の付け根に近い気管を確認します。

22ゲージ挿管ランプと直径0.4ミリメートルのガイドワイヤーを使用して、留置針カニューレを気管に挿入します。挿管を終了するには、ガイドワイヤーを取り外し、カニューレをマウスの気管に押し込みます。次に、カニューレが気管に入るのが見られたら、気管を通して50マイクロリットルの細胞懸濁液をレシピエントマウスに注入します。

24時間後、気管を介してブレオマイシンを投与し、特発性肺線維症を誘発する。また、等量の生理食塩水を対照群に投与する。21日後、線維症のマーカーの発現およびアシュクロフトスコアを評価することにより、肺線維症の重症度を決定する。

HE染色は、インターロイキン33刺激マクロファージの養子移入が、対照と比較して、ブレオマイシン刺激マウスにおける肺組織破壊の程度を悪化させ、線維芽細胞凝集を増加させることを示した。アシュクロフトスコアの増加は、肺線維症の程度も示しています。養子移入インターロイキン33刺激間質マクロファージを含み、ブレオマイシンで処理したレシピエントマウスの肺組織におけるアルファSMAおよびフィブロネクチンのmRNAの発現レベルは、BLM処理された野生型マウスと比較して高かった。

カニューレ内の細胞懸濁液が肺組織に完全に入ることができるように、500マイクロリットルの空気を1ミリメートルの注射器で直ちに肺に入れる必要があります。