يصف البروتوكول عزل IMS الرئوي والنقل بالتبني بعد تحديد IL-33 في نموذج الماوس ، والذي يمكن أن يسهل الدراسة في الجسم الحي للتليف الرئوي مجهول السبب. تمكن هذه التقنية الباحثين من استكشاف وظيفة البلاعم ، التي تحاكيها السيتوكينات التقليدية في تطوير IPF. للبدء ، أخرج قارورة كلودرونات ليبوزومات من الثلاجة.
اتركه يسخن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واقلبه عدة مرات لضمان خلط موحد. نضح 60 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية كلودرونات باستخدام ماصة مع طرف شفط معقم. إدارة السيطرة وإسقاط الدواء في تجويف الأنف للفأر المخدر.
بعد كل قطرة ، تأكد من أن الفأر يستنشق الدواء تماما ويتنفس بالتساوي. بعد استنفاد البلاعم السنخية في الماوس المتلقي ، ابدأ بتطهير جلد الفأر المضيف المخدر بنسبة 75٪ كحول واليود. استخدم المقص لقطع الجلد وكشف الأنسجة القلبية الرئوية.
نضح 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في حقنة مجهزة بإبرة قياس 20 ، وأدخل طرف الإبرة في الأذين الأيمن للماوس. ثم قطع الوريد الأجوف السفلي للفأر بمقص جراحي وتفريش الماوس يدويا باستخدام PBS بسرعة ثابتة من 10 إلى 20 ملليلتر في الدقيقة حتى تتحول أنسجة الرئة إلى اللون الأبيض. علاوة على ذلك ، قم باستئصال أنسجة الرئة ونقلها إلى برنامج تلفزيوني بارد في طبق ثقافة.
قطع أنسجة الرئة إلى أجزاء وإضافة 15 ملليلتر من وسط DMEM يحتوي على 1٪ كولاجيناز A لعزل الضامة ، ثم احتضانها عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على طاولة اهتزاز 37 درجة مئوية. نضح معلق أنسجة الرئة حوالي 20 مرة من خلال حقنة سعة 10 ملليلتر لجعلها جيدة. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
أجهزة الطرد المركزي المرشح في 400 غرام لمدة 10 دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، تحلل الدم الأحمر بثلاثة ملليلتر من محلول تحلل الخلايا على الجليد لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 150 G لمدة خمس دقائق وإعادة تعليق بيليه الخلية في 10 ملليلتر من DMEM.
ثم عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. قم بزرع الخلايا في طبق زراعة الخلايا الملتصق بطول 10 سم واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للصق الضامة الخلالية الرئوية بالأطباق. بعد ساعة واحدة ، استنشق الخلايا الطافية والعائمة.
أضف 10 ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج والكامل واحتضانه لأكثر من ثماني ساعات أو طوال الليل. لتحفيز الضامة الخلالية المعزولة ، استبدل وسط الاستزراع المستهلك بإنترلوكينات متوسطة كاملة 33. قم أيضا بإعداد لوحة تحكم عن طريق إضافة PBS بدلا من interleukins 33.
احتضان لوحات لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. لفصل الضامة الخلالية الرئوية ، تعامل مع ملليلتر واحد من 0.25 ٪ التربسين لمدة خمس دقائق. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من الثقافة الطازجة متوسطة كاملة لإخماد الهضم والطرد المركزي تعليق الخلية لحصاد الضامة الرئوية.
بعد عد الخلايا ، أعد تعليق الخلايا في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ خمسة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 50 ميكرولتر. لبدء نقل الضامة الخلالية ، قم بتثبيت أطراف الماوس المتلقي المخدر على لوحة عمودية بشريط طبي واسحب لسان الماوس برفق إلى جانب واحد ، باستخدام قطعة قطن. بعد تشغيل مصباح التنبيب ، قم بتشغيله على حلق الماوس لرؤية القصبة الهوائية ، والتي يجب أن تكون قريبة من قاعدة اللسان.
أدخل قنية إبرة السكن في القصبة الهوائية باستخدام مصباح التنبيب عيار 22 وسلك توجيه قطره 0.4 ملم. لإنهاء التنبيب ، قم بإزالة سلك التوجيه وادفع القنية إلى القصبة الهوائية للفأر. الآن حقن 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في الماوس المتلقي من خلال القصبة الهوائية عندما ينظر إلى القنية لدخول القصبة الهوائية.
بعد 24 ساعة، يتم تطبيق بليوميسين عبر القصبة الهوائية للحث على التليف الرئوي مجهول السبب. أيضا إدارة كمية متساوية من المياه المالحة للمجموعة الضابطة. بعد 21 يوما ، حدد درجة شدة التليف الرئوي من خلال تقييم التعبير عن علامات التليف ودرجات Ashcroft.
أظهر تلطيخ HE أن النقل بالتبني للإنترلوكينات 33 حفز البلاعم أدى إلى تفاقم درجة تدمير أنسجة الرئة وزيادة تراكم الخلايا الليفية في الفئران المحفزة ببليوميسين ، مقارنة بالسيطرة. توضح الزيادة في درجة Ashcroft أيضا درجة التليف الرئوي. كانت مستويات التعبير عن mRNA لألفا SMA والفبرونيكتين في أنسجة الرئة للفأر المتلقي الذي يحتوي على البلاعم الخلالية المحفزة بالإنترلوكين 33 المنقولة بالتبني والمعالجة بالبليوميسين أعلى ، مقارنة بتلك الموجودة في الفئران البرية المعالجة ب BLM.
يجب إدخال 500 ميكرولتر من الهواء على الفور إلى الرئتين باستخدام حقنة ملليمتر واحد لضمان أن تعليق الخلية في القنية يمكن أن يدخل أنسجة الرئة تماما.
