Протокол описывает выделение легочного ИМС и адоптивный перенос после определения IL-33 на мышиной модели, что может облегчить исследование идиопатического легочного фиброза in vivo. Этот метод позволяет исследователям исследовать функцию макрофагов, моделируемых традиционными цитокинами, в развитии IPF. Для начала достаньте из холодильника пузырек с клодронатными липосомами.
Дайте ему нагреться в течение 30 минут при комнатной температуре и несколько раз переверните, чтобы обеспечить равномерное перемешивание. Аспирируйте 60 микролитров клодронатных липосом с помощью пипетки со стерильным всасывающим наконечником. Вводите контроль и лекарство по каплям в носовую полость анестезированной мыши.
После каждой капли следите за тем, чтобы мышь полностью вдыхала препарат и дышала равномерно. После истощения альвеолярных макрофагов у мыши-реципиента начните с дезинфекции кожи анестезированной мыши-хозяина 75% спиртом и йодом. Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу и обнажить сердечно-легочную ткань.
Наберите 10 миллилитров PBS в шприц, оснащенный иглой 20-го калибра, и вставьте кончик иглы в правое предсердие мыши. Затем разрежьте нижнюю полую вену мыши хирургическими ножницами и вручную перфузируйте мышь PBS с постоянной скоростью от 10 до 20 миллилитров в минуту, пока легочная ткань не побелеет. Далее иссекают легочную ткань и переносят ее в ледяной PBS в культуральную чашку.
Разрежьте легочную ткань на фрагменты и добавьте 15 миллилитров среды DMEM, содержащей 1% коллагеназы А, чтобы изолировать макрофаги, затем инкубируйте ее при 100 об/мин в течение 30 минут на встряхивающем столе с температурой 37 градусов по Цельсию. Аспирируйте суспензию легочной ткани примерно 20 раз через 10-миллилитровый шприц, чтобы сделать ее нормальной. Отфильтруйте суспензию через 40-микрометровый сетчатый фильтр.
Центрифугируйте фильтрат при 400 г в течение 10 минут. После удаления надосадочной жидкости лизируйте красную кровь тремя миллилитрами буфера лизиса клеток на льду в течение двух-трех минут. Центрифугу при 150 г в течение пяти минут и ресуспендировать гранулу клетки в 10 миллилитрах DMEM.
Затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Посейте клетки в 10-сантиметровую адгезивную чашку для культивирования клеток и инкубируйте в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы приклеить интерстициальные макрофаги легких к чашкам. Через час аспирируйте надосадочную жидкость и плавающие клетки.
Добавьте 10 миллилитров свежей полноценной питательной среды и выдерживайте более восьми часов или в течение ночи. Для стимуляции выделенных интерстициальных макрофагов проводят замену отработанной питательной среды полноценной средой интерлейкинов 33. Также подготовьте контрольную пластину, добавив PBS вместо интерлейкинов 33.
Инкубируйте пластины в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы диссоциировать легочные интерстициальные макрофаги, обработайте их одним миллилитром 0,25% трипсина в течение пяти минут. Затем добавьте три миллилитра свежей культуры, полную среду, чтобы утолить пищеварение, и центрифугируйте клеточную суспензию для сбора легочных макрофагов.
После подсчета клеток ресуспендируют клетки в PBS до конечной концентрации в пять раз от 10 до пятых клеток на 50 микролитров. Чтобы начать перенос интерстициальных макрофагов, зафиксируйте конечности анестезированной мыши-реципиента на вертикальной пластине медицинской лентой и аккуратно потяните язык мыши в сторону, используя ватный тампон. Включив лампу интубации, посветите ею на горло мыши, чтобы увидеть трахею, которая должна находиться близко к основанию языка.
Вставьте внутреннюю игольчатую канюлю в трахею с помощью интубационной лампы 22-го калибра и направляющей проволоки диаметром 0,4 миллиметра. Чтобы закончить интубацию, удалите направляющую проволоку и вставьте канюлю в трахею мыши. Теперь введите 50 микролитров клеточной суспензии мыши-реципиенту через трахею, когда канюля войдет в трахею.
Через 24 часа вводите блеомицин через трахею, чтобы вызвать идиопатический легочный фиброз. Также введите равный объем физиологического раствора контрольной группе. Через 21 день определите степень тяжести легочного фиброза, оценив экспрессию маркеров фиброза и шкалы Эшкрофта.
Окрашивание HE показало, что адаптивный перенос интерлейкинов 33 стимулированных макрофагов усугублял степень разрушения легочной ткани и увеличивал агрегацию фибробластов у мышей, стимулированных блеомицином, по сравнению с контролем. Увеличение балла Эшкрофта также иллюстрирует степень легочного фиброза. Уровни экспрессии мРНК альфа-СМА и фибронектина в тканях легких мыши-реципиента, содержащей адоптивно перенесенные интерлейкины 33-стимулированные интерстициальные макрофаги и получавшие блеомицин, были выше по сравнению с таковыми у мышей дикого типа, получавших BLM.
500 микролитров воздуха следует немедленно ввести в легкие с помощью одномиллиметрового шприца, чтобы клеточная суспензия в канюле могла полностью проникнуть в легочную ткань.
