El protocolo describe el aislamiento del IMS pulmonar y la transferencia adoptiva después de la determinación de IL-33 en un modelo de ratón, lo que puede facilitar el estudio in vivo de la fibrosis pulmonar idiopática. La técnica permite a los investigadores explorar la función de los macrófagos, simulada por citoquinas tradicionales en el desarrollo de FPI. Para comenzar, saque el frasco de liposomas de clodronato del refrigerador.
Deje que se caliente durante 30 minutos a temperatura ambiente e invierta varias veces para asegurar una mezcla uniforme. Aspirar 60 microlitros de liposomas de clodronato usando una pipeta con una punta de succión estéril. Administrar el control y el fármaco gota a gota en la cavidad nasal del ratón anestesiado.
Después de cada gota, asegúrese de que el ratón inhale el medicamento por completo y respire uniformemente. Después del agotamiento de los macrófagos alveolares en el ratón receptor, comience desinfectando la piel del ratón huésped anestesiado con 75% de alcohol y yodo. Use tijeras para cortar a través de la piel y exponer el tejido cardiopulmonar.
Aspire 10 mililitros de PBS en una jeringa equipada con una aguja de calibre 20 e inserte la punta de la aguja en la aurícula derecha del ratón. Luego corte la vena cava inferior del ratón con tijeras quirúrgicas y perfunda manualmente el ratón con PBS a una velocidad constante de 10 a 20 mililitros por minuto hasta que el tejido pulmonar se vuelva blanco. Además, extirpe el tejido pulmonar y transfiéralo a PBS helado en una placa de cultivo.
Corte el tejido pulmonar en fragmentos y agregue 15 mililitros de medio DMEM que contenga 1% de colagenasa A para aislar los macrófagos, luego incube a 100 RPM durante 30 minutos en una mesa de agitación de 37 grados centígrados. Aspire la suspensión de tejido pulmonar aproximadamente 20 veces a través de una jeringa de 10 mililitros para que esté bien. Filtre la suspensión a través de un colador de células de 40 micrómetros.
Centrifugar el filtrado a 400 G durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, lisar la sangre roja con tres mililitros de tampón de lisis celular en hielo durante dos o tres minutos. Centrifugar a 150 G durante cinco minutos y resuspender el pellet celular en 10 mililitros de DMEM.
Luego cuente las células usando un hemocitómetro. Sembrar las células en una placa de cultivo celular adherente de 10 centímetros e incubar durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para adherir los macrófagos intersticiales pulmonares a los platos. Después de una hora, aspire el sobrenadante y las células flotantes.
Agregue 10 mililitros del medio de cultivo fresco y completo e incube durante más de ocho horas o durante la noche. Para estimular los macrófagos intersticiales aislados, sustituir el medio de cultivo gastado por un medio completo de interleucinas 33. También prepare una placa de control agregando PBS en lugar de interleucinas 33.
Incubar las placas durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para disociar los macrófagos intersticiales pulmonares, trátelos con un mililitro de tripsina al 0,25% durante cinco minutos. Luego agregue tres mililitros de medio completo de cultivo fresco para calmar la digestión y centrifugar la suspensión celular para cosechar los macrófagos pulmonares.
Después de contar las células, resuspender las células en PBS a una concentración final de cinco veces 10 a la quinta célula por 50 microlitros. Para comenzar la transferencia de macrófagos intersticiales, fije las extremidades del ratón receptor anestesiado en una placa vertical con cinta médica y tire suavemente de la lengua del ratón hacia un lado, usando un hisopo de algodón. Después de encender la lámpara de intubación, póngala en la garganta del ratón para ver la tráquea, que debe estar cerca de la base de la lengua.
Inserte la cánula de aguja permanente en la tráquea con la lámpara de intubación de calibre 22 y el alambre guía de 0,4 milímetros de diámetro. Para finalizar la intubación, retire el alambre guía y empuje la cánula en la tráquea del ratón. Ahora inyecte 50 microlitros de la suspensión celular en el ratón receptor a través de la tráquea cuando se vea que la cánula entra en la tráquea.
Después de 24 horas, administrar bleomicina a través de la tráquea para inducir fibrosis pulmonar idiopática. También administrar un volumen igual de solución salina al grupo de control. Después de 21 días, determinar el grado de gravedad de la fibrosis pulmonar mediante la evaluación de la expresión de marcadores de fibrosis y las puntuaciones de Ashcroft.
La tinción HE mostró que la transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por interleucinas 33 exacerbó el grado de destrucción del tejido pulmonar y aumentó la agregación de fibroblastos en los ratones estimulados por bleomicina, en comparación con el control. El aumento en la puntuación de Ashcroft también ilustra el grado de fibrosis pulmonar. Los niveles de expresión de ARNm de alfa SMA y fibronectina en los tejidos pulmonares del ratón receptor que contenía macrófagos intersticiales estimulados con interleucinas 33 transferidas adoptivamente y tratados con bleomicina fueron más altos, en comparación con los de los ratones de tipo salvaje tratados con BLM.
Se deben ingresar inmediatamente 500 microlitros de aire en los pulmones con una jeringa de un milímetro para garantizar que la suspensión celular en la cánula pueda ingresar completamente al tejido pulmonar.
