Das Protokoll beschreibt die Isolierung von pulmonalem IMS und den adoptiven Transfer nach IL-33-Bestimmung in einem Mausmodell, was die In-vivo-Untersuchung der idiopathischen Lungenfibrose erleichtern kann. Die Technik ermöglicht es den Forschern, die Funktion von Makrophagen zu untersuchen, die von traditionellen Zytokinen bei der Entwicklung von IPF simuliert wird. Nehmen Sie zunächst die Durchstechflasche mit Clodronat-Liposomen aus dem Kühlschrank.
Lassen Sie es 30 Minuten bei Raumtemperatur erwärmen und drehen Sie es mehrmals um, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten. Aspirieren Sie 60 Mikroliter Clodronat-Liposomen mit einer Pipette mit steriler Saugspitze. Verabreichen Sie die Kontrolle und das Medikament tropfenweise in die Nasenhöhle der anästhesierten Maus.
Stellen Sie nach jedem Tropfen sicher, dass die Maus das Medikament vollständig einatmet und gleichmäßig atmet. Nach der Erschöpfung der Alveolarmakrophagen in der Empfängermaus beginnen Sie mit der Desinfektion der Haut der anästhesierten Wirtsmaus mit 75% Alkohol und Jod. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut zu durchschneiden und das Herz-Lungen-Gewebe freizulegen.
Saugen Sie 10 Milliliter PBS in einer Spritze ab, die mit einer 20-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und führen Sie die Nadelspitze in den rechten Vorhof der Maus ein. Dann schneidet man die untere Hohlvene der Maus mit einer chirurgischen Schere ab und durchblutet die Maus manuell mit PBS bei einer konstanten Geschwindigkeit von 10 bis 20 Millilitern pro Minute, bis das Lungengewebe weiß wird. Entfernen Sie außerdem das Lungengewebe und übertragen Sie es in eine Kulturschale in eiskaltes PBS.
Schneiden Sie das Lungengewebe in Fragmente und fügen Sie 15 Milliliter DMEM-Medium hinzu, das 1% Kollagenase A enthält, um die Makrophagen zu isolieren, und inkubieren Sie es dann 30 Minuten lang bei 100 U / min auf einem 37 Grad Celsius heißen Schütteltisch. Aspirieren Sie die Lungengewebesuspension etwa 20 Mal durch eine 10-Milliliter-Spritze, um sie fein zu machen. Filtern Sie die Suspension durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb.
Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 400 G für 10 Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, lysieren Sie das rote Blut mit drei Millilitern Zelllysepuffer auf Eis für zwei bis drei Minuten. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 150 G und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern DMEM.
Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer. Säen Sie die Zellen in eine 10-Zentimeter-Zellkulturschale und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die interstitiellen Makrophagen der Lunge an die Schalen zu haften. Saugen Sie nach einer Stunde den Überstand und die schwebenden Zellen ab.
Fügen Sie 10 Milliliter des frischen, vollständigen Nährmediums hinzu und inkubieren Sie es über acht Stunden oder über Nacht. Um die isolierten interstitiellen Makrophagen zu stimulieren, ersetzen Sie das verbrauchte Kulturmedium durch ein vollständiges Medium Interleukine 33. Bereiten Sie auch eine Kontrollplatte vor, indem Sie PBS anstelle von Interleukinen 33 hinzufügen.
Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um die pulmonalen interstitiellen Makrophagen zu dissoziieren, behandeln Sie sie fünf Minuten lang mit einem Milliliter 0,25% Trypsin. Fügen Sie dann drei Milliliter frisches Kulturmedium hinzu, um die Verdauung zu stillen, und zentrifugieren Sie die Zellsuspension, um die Lungenmakrophagen zu ernten.
Nach dem Zählen der Zellen werden die Zellen in PBS auf eine Endkonzentration von fünf mal 10 bis zu den fünften Zellen pro 50 Mikroliter resuspendiert. Um mit der Übertragung von interstitiellen Makrophagen zu beginnen, fixieren Sie die Gliedmaßen der anästhesierten Empfängermaus mit medizinischem Klebeband auf einer vertikalen Platte und ziehen Sie die Zunge der Maus mit einem Wattestäbchen vorsichtig zur Seite. Nachdem Sie die Intubationslampe eingeschaltet haben, leuchten Sie sie auf den Hals der Maus, um die Luftröhre zu sehen, die sich in der Nähe der Zungenbasis befinden sollte.
Führen Sie die Verweilnadelkanüle mit der 22-Gauge-Intubationslampe und dem Führungsdraht mit einem Durchmesser von 0,4 Millimetern in die Luftröhre ein. Um die Intubation zu beenden, entfernen Sie den Führungsdraht und schieben Sie die Kanüle in die Luftröhre der Maus. Injizieren Sie nun 50 Mikroliter der Zellsuspension durch die Luftröhre in die Empfängermaus, wenn die Kanüle in die Luftröhre eindringt.
Verabreichen Sie Bleomycin nach 24 Stunden über die Luftröhre, um eine idiopathische Lungenfibrose zu induzieren. Verabreichen Sie der Kontrollgruppe auch eine gleiche Menge Kochsalzlösung. Bestimmen Sie nach 21 Tagen den Schweregrad der Lungenfibrose, indem Sie die Expression von Markern für Fibrose und die Ashcroft-Scores bewerten.
Die HE-Färbung zeigte, dass der adoptive Transfer von Interleukin-33-stimulierten Makrophagen den Grad der Zerstörung des Lungengewebes und die erhöhte Fibroblastenaggregation bei den Bleomycin-stimulierten Mäusen im Vergleich zur Kontrolle verschlimmerte. Der Anstieg des Ashcroft-Scores veranschaulicht auch den Grad der Lungenfibrose. Die Expressionsniveaus von mRNA von alpha SMA und Fibronektin in Lungengeweben der Empfängermaus, die adoptativ übertragene Interleukine 33-stimulierte interstitielle Makrophagen enthielten und mit Bleomycin behandelt wurden, waren höher als bei den BLM-behandelten Wildtyp-Mäusen.
500 Mikroliter Luft sollten sofort mit einer Ein-Millimeter-Spritze in die Lunge eingeführt werden, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension in der Kanüle vollständig in das Lungengewebe eindringen kann.
