במהלך רישום הדמיית סידן, התאים נעים לכל הכיוונים. כלים רבים פותחו כדי לתקן את תנועת X ו- Y, אך גם תנועה על ציר Z צריכה להיות מאובחנת ומתוקנת במפורש. TACI הוא תוסף J לתמונת קוד פתוח ידידותי למשתמש.
הוא בודק סחף Z ומנתח הדמיה תלת ממדית של סידן עם תנועה לכל הכיוונים. לאחר הכנת זחלי הזבוב, שטפו אותם ב-PBS שלוש פעמים. פיפטה 75 מיקרוליטר של PBS על מרכז מגלשת זכוכית.
שים זחל אחד או שניים PBS ומניחים את micrprobe thermocouple ליד הזחלים. כסו את הזחלים ואת המיקרו-פרוב התרמוזוגי בכיסוי זכוכית, החליקו ואטמו אותו בלק. הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ.
מצא את המיקוד באמצעות מטרה של פי 25 והנח את המצנן התרמו-חשמלי על המגלשה. בתוכנות קונפוקליות, התמקדו בתאים הפלואורסצנטיים המעניינים. התאימו את עוצמת הלייזר כדי למנוע רוויית יתר וקבעו את מיקום הפרוסה הראשונה והאחרונה בקביעת מחסנית Z.
בו-זמנית, הפעל את סריקת מחסנית Z ואת הקלטת הטמפרטורה. שלוט בספק הכוח המניע את הפלטייה כדי לשנות את טמפרטורת פני השטח של הפלטייה. לאחר מכן, הפסק את סריקת מחסנית Z ואת רישום הטמפרטורה.
לאחר הורדת צנצנת הנקודות TACI להדמיית סידן, התקן את התוסף בפיג'י על ידי לחיצה על תוספים בשורת התפריטים, ולאחר מכן התקן בתפריט הנפתח. לאחר מכן הפעל מחדש את פיג'י והפעל את התוסף על ידי לחיצה על תוספים ובחירה בהדמיית סידן TACI. בחר בפונקציית שינוי השם כדי להמיר את שמות קובצי TIFF למבנה הנדרש.
בחר את התיקייה שבה יש לשנות את שמן של תמונות TIFF על-ידי לחיצה על עיון בתיקיות והמתן עד ששם הקובץ יתמלא באופן אוטומטי באמצעות שם התיקייה. בדוק את מיקום ה- T המרבי ואת המיקום המרבי Z. ודא שערכי הפרמטרים עבור מיקום T מרבי ומיקום Z מרבי כוללים את כל הספרות.
הזן את המיקום של כל פרמטר לפי הסדר. אם שמות הקבצים של TIFF אינם כוללים את צירוף המילים ואת הערוץ, השאר את ערך הפרמטר המתאים ריק ובחר NA לפי הסדר. אם יש Posttext, נוסף לפרמטר posttext.
לחץ על שנה שם כדי ליצור תיקייה בעלת שם זהה, ולאחר מכן סמן קו תחתון R.שים לב ששמות הקבצים של TIFF נבנו מחדש בתיקיה כך שיהיו תואמים לפונקציה ארגון. לאחר מכן, השתמש בפונקציה organize כדי לשמור את תמונות TIFF באותו מיקום Z בתיקייה אחת. בחר את התיקיה שבה יש לארגן את תמונות T על-ידי לחיצה על עיון בתיקיות.
אם קובץ CSV של הפרמטר קיים, המתן עד שערכי הפרמטרים ימולאו אוטומטית. אם קובץ CSV של הפרמטר אינו קיים, מלא ידנית את ערכי הפרמטרים. ודא שערכי הפרמטרים של פאזה וערוץ כוללים אותיות, בעוד שערכי הפרמטרים של מיקום T ומיקום Z צריכים להיות המספרים הגדולים ביותר של מיקומי T ו- Z.
אם שמות קובצי התמונה אינם כוללים את הפאזה או הערוץ, הזינו NA. לאחר מכן צור תמונות TIFF בקנה מידה אפור בעת הצורך, על-ידי בדיקה שהתיבה R images gra אינה מסומנת. לחץ על ארגן כדי ליצור תיקייה באותו שם ואחריו אוספי קו תחתון אפורים, וכדי ליצור תיקיות באותו שם ואחריו קו תחתון ומספר מיקום Z בתיקיה. לאחר מכן שימו לב שקובצי TIFF ממוינים לתיקיות מתאימות לפי מיקומי Z, ושנוצר קובץ בשם param dot CSV שבו ניתן למצוא את הפרמטרים ואת הערכים שלהם.
כעת השתמשו ב-trackmate בפיג'י כדי לחלץ את עוצמות הפלואורסצנטיות של התאים המעניינים מכל מיקום Z. פתח את תמונות TIFF בתיקיית מיקום Z על ידי פיג'י והפעל את TRACKMATE על ידי לחיצה על תוספים ובחירה מעקב, ואחריו Trackmate. התאם את הפרמטרים באמצעות גלאי DOG או LOG.
שנה את סף קוטר הכתמים ואת מסנן החציון. הגדר את המסננים כדי להסיר את האותות הלא רלוונטיים. הגדר את המרחק המרבי המקשר, המרחק המרבי לסגירת הרווח ומרווח המסגרת המרבי לסגירת רווח.
יצא את עוצמות הפלואורסצנטיות של אזורי העניין לקובץ CSV. עבור כל תא עצב, צור תיקייה ותן לה שם באמצעות מספר תא העצב. החל מנוירון אפס.
שמור את קובצי ה- CSV המכילים את המידע הפלואורסצנטי של תא העצב המתאים בתיקיה. תן לקובצי ה- CSV שם כעוצמה ממוצעת Z מיקום מספר נקודה CSV וכלול לפחות שתי עמודות, מיקום T ועוצמה ממוצעת, או עוצמה ממוצעת ערוץ ראשון. צור את קובץ ה- CSV של רשימת המקפים התחתונים ברקע המכיל את המידע של כל תאי העצב בתבנית מסוימת, החל מתא עצב אפס.
מלא את מספרי תאי העצב כגון נוירון אפס בשורה הראשונה. לאחר מכן ספק את עוצמת הרקע עבור כל מיקום Z שניתח. אם מנתחים ארבעה מיקומי Z עבור נוירון אפס, מלא ארבעה ערכי עוצמת רקע מתחת לאפס נוירון.
שמור את רשימת הרקע שנוצרה, נקודה, קובץ CSV ותיקיות המכילות את קבצי ה- CSV של מידע הפלואורסצנטיות בתיקיה אחת. פתח את TACI ובחר את פונקציית החילוץ. לאחר מכן בחר את התיקיה על ידי לחיצה על עיון בקבצים.
קובץ הרקע מתמלא באופן אוטומטי. מלא את המספר הגדול ביותר של עמדות T עבור מספר עמדות T. לחץ על חלץ כדי ליצור תיקיית תוצאות הכוללת את קבצי ה- CSV והתרשימים של כל תא עצב.
קובצי CSV כוללים את עוצמת הפלואורסצנטיות המרבית, ואת דלתא F מעל דלתא אפס בכל מיקום T. החלקות הן תרשימי קו של דלתא F מעל F אפס לעומת T מיקומים. באמצעות פונקציית המיזוג, ממוצע הדלתא F על F אפס מכל הנוירונים.
חשב את ה- SEM והתווה את הדלתא הממוצעת F על F אפס על מיקומי T. בחר את תיקיית התוצאות שנוצרה על ידי פונקציית החילוץ על ידי לחיצה על עיון בקבצים. מלא את מספר עמדות T עם המספר הגדול ביותר של עמדות T.
לחץ על מזג כדי ליצור תיקיית נתונים ממוזגת, כולל קובץ CSV של נתונים עם קו תחתון ממוזג וקו תחתון ממוצע DF קו תחתון F אפס נקודה PNG. קובץ ה- CSV כולל את המידע הממוצע והדלתא של SEM F מעל F אפס בכל מיקום T. העלילה היא תרשים קו של הדלתא הממוצעת F מעל F אפס מעל מיקומי T.
הדמיית סידן של תאי קירור של זחלי זבובים המבטאים GCaMP שישה M בקושי מראה פלואורסצנטיות במצב הלא פעיל ב 27 מעלות צלזיוס. עם זאת, רמות הסידן התוך-תאי עלו במהירות ב-10 מעלות צלזיוס. רמות הסידן ירדו במהירות כאשר הטמפרטורה עלתה.
הדמיית סידן של נוירוני מוח זבוב המבטאים GCaMP שישה F בזמן 0.1 הראתה פלואורסצנטיות בארבעה מתוך שבעת תאי העצב, ועוצמתם של נוירונים אלה ירדה עם הזמן. בנוכחות אוקטינל, נוירונים מרובים התבהרו. הפלואורסצנטיות של 10 תאי עצב גדלה בו זמנית בנקודת זמן 92, מה שמרמז על כך שתאי עצב פטרייתיים אלה מגיבים לריח אוקטינלי.
TACI יכול להפריד תאים חופפים. בתמונת הקרנה מקסימלית זו זוהו שני תאי עצב חופפים. תאי עצב אלה הופרדו בתצוגת האורתרו, מה שמצביע על כך שתאי עצב אלה הופיעו בתנוחות Z שונות.
התא הכתום הראה את האות החזק ביותר ב-Z שבע ואילו התא הכחול הראה את האות החזק ביותר ב-Z 10. השינוי בפלואורסצנטיות של שני התאים הללו חשף את ההפעלה המאוחרת אך החזקה של התא הכתום. במהלך החילוץ, הערך הפלואורסצנטי המרבי מכל מיקומי Z שבהם נוירון מופיע משמש לייצוג עוצמת הנוירון בתצהיר המתאים.
אם משתמשים ב-TACI כדי לנתח מספר גדול של נוירונים, רישום מסוים על פני מיקומי Z צריך להיכלל בפונקציה חדשה שתפותח מאורגנת עם מידע פלואורסצנטי. TACI מספקת גישה חישובית ידידותית למשתמש בקוד פתוח לניתוח הדמיה תלת-ממדית של קפסולות כדי לבדוק את תנועת התאים על ציר Z כאשר תאים בודדים מופיעים במספר מיקומי Z.
