Pendant l’enregistrement de l’imagerie calcique, les cellules se déplacent dans toutes les directions. De nombreux outils ont été développés pour corriger le mouvement X et Y, mais le mouvement sur l’axe Z doit également être explicitement diagnostiqué et corrigé. TACI est un plug-in d’image J open source convivial.
Il vérifie la dérive Z et analyse l’imagerie calcique 3D avec mouvement dans toutes les directions. Après avoir préparé les larves de mouches, rincez-les trois fois dans du PBS. Pipette 75 microlitres de PBS au centre d’une lame de verre.
Mettez une ou deux larves dans du PBS et placez le thermocouple micrprobe près des larves. Couvrez les larves et la microsonde thermocouple avec un couvercle en verre et scellez-le avec du vernis à ongles. Placez la lame sur la platine du microscope.
Trouvez la mise au point à l’aide d’un objectif 25 fois et placez le refroidisseur thermoélectrique sur la glissière. Dans les logiciels confocaux, concentrez-vous sur les cellules fluorescentes d’intérêt. Ajustez la puissance laser pour éviter la sursaturation et définissez les positions de première et de dernière tranche dans le paramètre de pile Z.
Simultanément, démarrez le balayage de la pile Z et l’enregistrement de la température. Contrôlez l’alimentation électrique qui alimente le Peltier pour modifier la température de surface du Peltier. Ensuite, arrêtez le balayage de la pile Z et l’enregistrement de la température.
Après avoir téléchargé le pot de points d’imagerie calcique TACI, installez le plugin aux Fidji en cliquant sur plugins dans la barre de menus, puis installez dans le menu déroulant. Ensuite, redémarrez Fiji et exécutez le plugin en cliquant sur plugins et en choisissant TACI calcium imaging. Choisissez la fonction renommer pour convertir les noms de fichiers TIFF à la structure requise.
Choisissez le dossier dans lequel les images TIFF doivent être renommées en cliquant sur Parcourir les dossiers et attendez que le nom du fichier soit rempli automatiquement à l’aide du nom du dossier. vérifiez la position max T et la position max Z. Assurez-vous que les valeurs des paramètres pour la position T maximale et la position Z maximale incluent tous les chiffres.
Entrez la position de chaque paramètre dans l’ordre. Si les noms de fichiers TIFF n’incluent pas la phrase et le canal, laissez la valeur de paramètre correspondante vide et choisissez NA dans l’ordre. S’il y a du posttext, ajouté au paramètre posttext.
Cliquez sur Renommer pour créer un dossier portant le même nom, suivi d’un trait de soulignement R.Observez que les noms de fichiers TIFF ont été restructurés dans le dossier pour être compatibles avec la fonction d’organisation. Ensuite, utilisez la fonction d’organisation pour enregistrer les images TIFF dans la même position Z dans un dossier. Choisissez le dossier dans lequel les images T doivent être organisées en cliquant sur Parcourir les dossiers.
Si le fichier CSV de paramètre existe, attendez que les valeurs des paramètres soient remplies automatiquement. Si le fichier CSV de paramètre n’existe pas, renseignez manuellement les valeurs des paramètres. Assurez-vous que les valeurs de paramètre de phase et de canal incluent des lettres si elles sont présentes, tandis que les valeurs de paramètre de la position T et de la position Z doivent être les plus grands nombres des positions T et Z.
Si les noms des fichiers image n’incluent pas la phase ou le canal, entrez NA. Créez ensuite des images TIFF en niveaux de gris si nécessaire en vous assurant que la case R images grises n’est pas cochée. Cliquez sur Organiser pour créer un dossier portant le même nom suivi de piles de traits de soulignement gris et pour générer des dossiers portant le même nom suivi d’un trait de soulignement et du numéro de position Z dans le dossier. Observez ensuite que les fichiers TIFF sont triés dans les dossiers correspondants par positions Z, et qu’un fichier nommé param dot CSV est généré dans lequel les paramètres et leurs valeurs peuvent être trouvés.
Utilisez maintenant trackmate aux Fidji pour extraire les intensités de fluorescence des cellules d’intérêt de chaque position Z. Ouvrez les images TIFF dans un dossier de position Z par Fidji et exécutez TRACKMATE en cliquant sur plugins et en sélectionnant tracking, suivi de Trackmate. Ajustez les paramètres à l’aide de détecteurs DOG ou LOG.
Modifiez le seuil de diamètre de l’objet blob et le filtre médian. Définissez les filtres pour supprimer les signaux non pertinents. Définissez la distance maximale de liaison, la distance maximale de fermeture de l’écart et l’écart maximal de fermeture de l’espace.
Exportez les intensités de fluorescence des régions d’intérêt vers un fichier CSV. Pour chaque neurone, créez un dossier et nommez-le en utilisant le numéro de neurone. À partir du neurone zéro.
Enregistrez les fichiers CSV contenant les informations de fluorescence du neurone correspondant dans le dossier. Nommez les fichiers CSV en tant qu’intensité moyenne Z position number point CSV et incluez au moins deux colonnes, position T et intensité moyenne, ou intensité moyenne canal un. Créez le fichier CSV de la liste des points de soulignement en arrière-plan qui contient les informations de tous les neurones dans un format spécifique, à partir du neurone zéro.
Remplissez les nombres de neurones tels que neurone zéro dans la première ligne. Indiquez ensuite l’intensité de fond pour chaque position Z analysée. Si quatre positions Z sont analysées pour le neurone zéro, remplissez quatre valeurs d’intensité de fond inférieures au neurone zéro.
Enregistrez le fichier CSV de liste d’arrière-plan créé et les dossiers contenant les fichiers CSV des informations de fluorescence dans un dossier. Ouvrez TACI et choisissez la fonction d’extraction. Choisissez ensuite le dossier en cliquant sur parcourir les fichiers.
Le fichier d’arrière-plan est automatiquement rempli. Remplissez le plus grand nombre de positions T pour le nombre de positions T. Cliquez sur Extraire pour créer un dossier de résultats comprenant les fichiers CSV et les tracés de chaque neurone.
Les fichiers CSV incluent l’intensité de fluorescence maximale et delta F sur delta zéro à chaque position T. Les graphiques sont des graphiques linéaires de delta F sur F zéro par rapport aux positions T. En utilisant la fonction de fusion, faites la moyenne du delta F sur F zéro de tous les neurones.
Calculez le MEB et tracez le delta F moyen sur F zéro sur les positions T. Choisissez le dossier de résultats créé par la fonction d’extraction en cliquant sur parcourir les fichiers. Remplissez le nombre de positions T avec le plus grand nombre de positions T.
Cliquez sur Fusionner pour créer un dossier de données fusionné, comprenant un fichier CSV de données soulignées fusionnées et un tracé PNG DF de soulignement DF moyen. Le fichier CSV comprend la moyenne et les informations SEM delta F sur F zéro à chaque position T. Le graphique est un graphique linéaire de la moyenne delta F sur F zéro sur T positions.
L’imagerie calcique des cellules froides de larves de mouches exprimant GCaMP six M montre à peine une fluorescence à l’état inactif à 27 degrés Celsius. Cependant, les niveaux de calcium intracellulaire ont rapidement augmenté à 10 degrés Celsius. Les niveaux de calcium ont rapidement chuté lorsque la température a augmenté.
L’imagerie calcique des neurones cérébraux de mouches exprimant GCaMP six F au temps 0,1 a montré une fluorescence dans quatre des sept neurones, et l’intensité de ces neurones a diminué avec le temps. En présence d’octinal, plusieurs neurones se sont éclairés. La fluorescence de 10 neurones a augmenté simultanément au point de temps 92, suggérant que ces neurones champignons répondent à l’odeur octinale.
TACI peut séparer les cellules qui se chevauchent. Dans cette image de projection maximale, deux neurones qui se chevauchent ont été identifiés. Ces neurones ont été séparés dans la vue orthro, indiquant que ces neurones sont apparus dans différentes positions Z.
La cellule orange a montré le signal le plus fort sur Z sept tandis que la cellule bleue a eu le signal le plus fort sur Z 10. Le changement de fluorescence de ces deux cellules a révélé l’activation retardée mais forte de la cellule orange. Lors de l’extraction, la valeur de fluorescence maximale de toutes les positions Z dans lesquelles un neurone apparaît est utilisée pour représenter l’intensité du neurone au dépôt correspondant.
Si vous utilisez TACI pour analyser un grand nombre de neurones, une certaine inscription à travers les positions Z doit être incluse dans une nouvelle fonction à développer organisée avec des informations de fluorescence. TACI fournit une approche informatique conviviale et open source pour l’analyse d’imagerie de capsules 3D afin de vérifier le mouvement des cellules sur l’axe Z lorsque des cellules individuelles apparaissent dans plusieurs positions Z.
