カルシウムイメージングの記録中、細胞はあらゆる方向に移動します。XとYの動きを補正するために多くのツールが開発されていますが、Z軸の動きも明示的に診断して修正する必要があります。TACIは、ユーザーフレンドリーなオープンソースの画像Jプラグインです。
Zドリフトをチェックし、全方向の動きで3Dカルシウムイメージングを分析します。ハエの幼虫を準備した後、PBSで3回すすいでください。75マイクロリットルのPBSをスライドガラスの中央にピペットで貼り付けます。
1つまたは2つの幼虫をPBSに入れ、熱電対マイクロプローブを幼虫の近くに置きます。幼虫と熱電対のマイクロプローブをガラスカバースリップで覆い、マニキュアで密封します。スライドを顕微鏡ステージに置きます。
25倍の対物レンズを使用して焦点を見つけ、熱電冷却器をスライドに配置します。共焦点ソフトウェアでは、目的の蛍光細胞に焦点を合わせます。過飽和を避けるためにレーザー出力を調整し、Zスタック設定で最初と最後のスライス位置を設定します。
同時に、Zスタックスキャンと温度記録を開始します。ペルチェに電力を供給する電源を制御して、ペルチェの表面温度を変更します。その後、Zスタックスキャンと温度記録を停止します。
TACIカルシウムイメージングドットジャーをダウンロードした後、メニューバーのプラグインをクリックしてフィジーにプラグインをインストールし、ドロップダウンメニューでインストールします。次に、フィジーを再起動し、プラグインをクリックしてTACIカルシウムイメージングを選択してプラグインを実行します。名前変更機能を選択して、TIFF ファイル名を必要な構造に変換します。
[フォルダの参照]をクリックしてTIFF画像の名前を変更する必要があるフォルダを選択し、ファイル名が自動的に入力されるのを待ちます フォルダ名を使用.最大T位置と最大Z位置を確認してください。最大T位置と最大Z位置のパラメーター値にすべての桁が含まれていることを確認してください。
各パラメータの位置を順番に入力します。TIFF ファイル名にフレーズとチャネルが含まれていない場合は、対応するパラメーター値を空白のままにして、順番に NA を選択します。ポストテキストがある場合は、posttext パラメーターに追加します。
[名前の変更] をクリックして同じ名前のフォルダーを作成し、その後に下線を付けます。 R.TIFFファイル名が整理機能と互換性があるようにフォルダー内で再構築されていることを確認してください。次に、整理機能を使用して、TIFF画像を1つのフォルダーの同じZ位置に保存します。[フォルダーの参照] をクリックして、T イメージを整理する必要があるフォルダーを選択します。
パラメーター CSV ファイルが存在する場合は、パラメーター値が自動的に入力されるのを待ちます。パラメーター CSV ファイルが存在しない場合は、パラメーター値を手動で入力します。位相とチャネルのパラメーター値に文字が含まれている場合は文字が含まれていることを確認し、T 位置と Z 位置のパラメーター値は T 位置と Z 位置の最大数である必要があります。
イメージ ファイル名に位相またはチャネルが含まれていない場合は、NA と入力します。次に、必要に応じて、ボックスRの画像グレーがオフになっていることを確認して、グレースケールTIFF画像を作成します。[整理] をクリックして、同じ名前の後にアンダースコアのグレーの下線スタックが付いたフォルダーを作成し、同じ名前の後にアンダースコアとフォルダー内の Z 位置番号が続くフォルダーを生成します。次に、TIFF ファイルが Z 位置で対応するフォルダーに並べ替えられ、パラメーターとその値が見つかる param dot CSV という名前のファイルが生成されることを確認します。
次に、フィジーのトラックメイトを使用して、各Z位置から目的の細胞の蛍光強度を抽出します。フィジーのZポジションフォルダにあるTIFF画像を開き、プラグインをクリックしてトラッキングを選択し、続いてトラックメイトを選択してTRACKMATEを実行します。DOGまたはLOG検出器を使用してパラメータを調整します。
BLOB の直径のしきい値と中央値フィルターを変更します。無関係な信号を削除するようにフィルターを設定します。リンクの最大距離、ギャップを閉じる最大距離、およびギャップを閉じる最大フレームギャップを設定します。
関心領域の蛍光強度をCSVファイルにエクスポートします。ニューロンごとにフォルダーを作成し、ニューロン番号を使用して名前を付けます。ニューロンゼロから始まります。
対応するニューロンの蛍光情報を含むCSVファイルをフォルダに保存します。CSV ファイルに平均強度 Z 位置番号ドット CSV という名前を付け、少なくとも 2 つの列、位置 T と平均強度、または平均強度チャネル 1 を含めます。ニューロンゼロから始まる特定の形式ですべてのニューロンの情報を含む背景アンダースコアリストドットCSVファイルを作成します。
ニューロン 0 などのニューロン番号を 1 行目に入力します。次に、分析された各Z位置のバックグラウンド強度を提供します。ニューロン 0 について 4 つの Z 位置を分析する場合は、ニューロン 0 より下の 4 つのバックグラウンド強度値を入力します。
作成したバックグラウンドリストドットCSVファイルと蛍光情報のCSVファイルを含むフォルダを1つのフォルダに保存します。TACI を開き、抽出機能を選択します。次に、ファイルの参照をクリックしてフォルダを選択します。
バックグラウンドファイルは自動的に入力されます。T 位置の数に対して、T 位置の最大数を入力します。抽出をクリックして、各ニューロンのCSVファイルとプロットを含む結果フォルダーを作成します。
CSVファイルには、最大蛍光強度と、各T位置でのデルタゼロに対するデルタFが含まれています。プロットは、Fゼロ対T位置に対するデルタFの折れ線グラフです。マージ関数を使用して、すべてのニューロンからのFゼロに対するデルタFを平均します。
SEMを計算し、T位置に対するFゼロに対する平均デルタFをプロットします。ファイルの参照をクリックして、抽出機能によって作成された結果フォルダーを選択します。T位置の数をT位置の最大数で入力します。
マージをクリックして、マージされたアンダースコア付きデータCSVファイルと平均アンダースコアDFアンダースコアFゼロドットPNGプロットを含むマージデータフォルダーを作成します。CSV ファイルには、各 T 位置の平均および SEM デルタ F オーバー F ゼロの情報が含まれています。プロットは、T位置上のFゼロに対する平均デルタFの折れ線グラフです。
GCaMP six Mを発現するハエ幼生クール細胞のカルシウムイメージングでは、摂氏27度で不活性状態ではほとんど蛍光が見られませんでした。しかし、細胞内のカルシウムレベルは摂氏10度で急速に増加しました。温度を上げるとカルシウムレベルは急速に低下しました。
時間0.1でGCaMP six Fを発現するハエ脳ニューロンのカルシウムイメージングは、7つのニューロンのうち4つで蛍光を示し、これらのニューロンの強度は時間とともに減少しました。オクチナールの存在下では、複数のニューロンが明るくなった。10個のニューロンの蛍光は時点92で同時に増加し、これらのキノコニューロンがオクチン臭に応答することを示唆しています。
TACI は、重なり合うセルを分離できます。この最大投影画像では、2つの重なり合うニューロンが同定された。これらのニューロンはオルスロビューで分離され、これらのニューロンが異なるZ位置に現れたことを示しています。
オレンジ色のセルはZ 7で最も強い信号を示し、青いセルはZ 10で最も強い信号を示しました。これら2つの細胞の蛍光の変化は、オレンジ色の細胞の遅延しているが強い活性化を明らかにした。抽出中、ニューロンが出現するすべてのZ位置からの最大蛍光値を使用して、対応する沈着におけるニューロンの強度を表す。
TACIを使用して多数のニューロンを分析する場合、Z位置にわたるいくつかの登録は、蛍光情報で編成されて開発される新しい機能に含まれる必要があります。TACIは、個々の細胞が複数のZ位置に現れるときにZ軸上の細胞の動きをチェックするための、3Dカプセルイメージング分析のためのユーザーフレンドリーなオープンソースの計算アプローチを提供します。
