Durante o registro de imagens de cálcio, as células se movem em todas as direções. Muitas ferramentas foram desenvolvidas para corrigir o movimento X e Y, mas o movimento no eixo Z também precisa ser explicitamente diagnosticado e corrigido. TACI é um plug-in J de imagem de código aberto fácil de usar.
Ele verifica a deriva Z e analisa imagens de cálcio 3D com movimento em todas as direções. Depois de preparar as larvas da mosca, enxágue-as em PBS três vezes. Pipeta 75 microlitros de PBS no centro de uma lâmina de vidro.
Coloque uma ou duas larvas em PBS e coloque a microssonda termopar perto das larvas. Cubra as larvas e a microssonda do termopar com uma tampa de vidro e sele com esmalte. Coloque a lâmina no palco do microscópio.
Encontre o foco usando uma objetiva de 25 vezes e coloque o resfriador termoelétrico no slide. Em software confocal, concentre-se nas células fluorescentes de interesse. Ajuste a potência do laser para evitar a supersaturação e defina a primeira e a última posição da fatia na configuração da pilha Z.
Simultaneamente, inicie a varredura da pilha Z e o registro de temperatura. Controle a fonte de alimentação que alimenta o Peltier para alterar a temperatura da superfície do Peltier. Depois, pare a varredura da pilha Z e a gravação de temperatura.
Depois de baixar o TACI calcium imaging dot jar instalar o plugin em Fiji clicando em plugins na barra de menus, seguido de instalar no menu suspenso. Em seguida, reinicie Fiji e execute o plugin clicando em plugins e escolhendo TACI imagem de cálcio. Escolha a função renomear para converter os nomes de arquivo TIFF para a estrutura necessária.
Escolha a pasta na qual as imagens TIFF precisam ser renomeadas clicando em procurar pastas e aguarde até que o nome do arquivo seja preenchido automaticamente Usando o nome da pasta. verifique a posição T máxima e a posição Z máxima. Certifique-se de que os valores dos parâmetros para a posição máxima T e a posição máxima Z incluam todos os dígitos.
Insira a posição de cada parâmetro em ordem. Se os nomes de arquivo TIFF não incluírem a frase e o canal, deixe o valor do parâmetro correspondente em branco e escolha NA na ordem. Se houver algum posttext, adicionado ao parâmetro posttext.
Clique em renomear para criar uma pasta com o mesmo nome, seguido de sublinhado R.Observe que os nomes de arquivo TIFF foram reestruturados na pasta para serem compatíveis com a função organizar. Em seguida, use a função organizar para salvar as imagens TIFF na mesma posição Z em uma pasta. Escolha a pasta na qual as imagens T precisam ser organizadas clicando em procurar pastas.
Se o arquivo CSV de parâmetro existir, aguarde até que os valores de parâmetro sejam preenchidos automaticamente. Se o arquivo CSV de parâmetro não existir, preencha manualmente os valores de parâmetro. Certifique-se de que os valores dos parâmetros de fase e canal incluam letras, se houver, enquanto os valores dos parâmetros da posição T e da posição Z devem ser os maiores números das posições T e Z.
Se os nomes dos arquivos de imagem não incluírem a fase ou o canal, insira NA. Em seguida, crie imagens TIFF em escala de cinza quando necessário, certificando-se de que a caixa R imagens cinza está desmarcada. Clique em organizar para criar uma pasta com o mesmo nome seguida de pilhas de sublinhado cinza e para gerar pastas com o mesmo nome seguido de sublinhado e o número da posição Z na pasta. Em seguida, observe que os arquivos TIFF são classificados em pastas correspondentes por posições Z, e que um arquivo chamado param dot CSV é gerado no qual os parâmetros e seus valores podem ser encontrados.
Agora use trackmate em Fiji para extrair as intensidades de fluorescência das células de interesse de cada posição Z. Abra as imagens TIFF em uma pasta de posição Z por Fiji e execute TRACKMATE clicando em plugins e selecionando rastreamento, seguido por Trackmate. Ajuste os parâmetros usando detectores DOG ou LOG.
Altere o limite de diâmetro do blob e o filtro mediano. Defina os filtros para remover os sinais irrelevantes. Defina a distância máxima de ligação, a distância máxima de fechamento da lacuna e a distância máxima de fechamento da lacuna.
Exporte as intensidades de fluorescência das regiões de interesse para um arquivo CSV. Para cada neurônio, crie uma pasta e nomeie-a usando o número do neurônio. A partir do neurônio zero.
Salve os arquivos CSV que contêm as informações de fluorescência do neurônio correspondente na pasta. Nomeie os arquivos CSV como intensidade média Z número de posição ponto CSV e inclua pelo menos duas colunas, posição T e intensidade média ou intensidade média canal um. Crie o arquivo CSV de ponto da lista de sublinhado de fundo que contém as informações de todos os neurônios em um formato específico, a partir do neurônio zero.
Preencha os números dos neurônios, como o neurônio zero, na linha um. Em seguida, forneça a intensidade de fundo para cada posição Z analisada. Se quatro posições Z forem analisadas para o neurônio zero, preencha quatro valores de intensidade de fundo abaixo do neurônio zero.
Salve o arquivo CSV de pontos da lista de plano de fundo criado e as pastas que contêm os arquivos CSV das informações de fluorescência em uma pasta. Abra o TACI e escolha a função de extração. Em seguida, escolha a pasta clicando em procurar arquivos.
O arquivo em segundo plano é preenchido automaticamente. Preencha o maior número de posições T para o número de posições T. Clique em extrair para criar uma pasta de resultados incluindo os arquivos CSV e gráficos de cada neurônio.
Os arquivos CSV incluem a intensidade máxima de fluorescência e delta F sobre delta zero em cada posição T. Os gráficos são gráficos de linhas de delta F sobre F zero versus posições T. Usando a função de mesclagem, a média do delta F sobre F zero de todos os neurônios.
Calcule o MEV e plote o delta médio F sobre F zero sobre as posições T. Escolha a pasta de resultados criada pela função extract clicando em procurar arquivos. Preencha o número de posições T com o maior número de posições T.
Clique em mesclar para criar uma pasta de dados mesclada, incluindo um arquivo CSV de dados sublinhados mesclados e um gráfico PNG de sublinhado DF de sublinhado de ponto zero F. O arquivo CSV inclui a média e as informações do delta do SEM F sobre F zero em cada posição T. O gráfico é um gráfico de linhas do delta médio F sobre F zero sobre posições T.
A imagem de cálcio de células frias larvais de moscas expressando GCaMP seis M quase não mostra qualquer fluorescência no estado inativo a 27 graus Celsius. No entanto, os níveis de cálcio intracelular aumentaram rapidamente a 10 graus Celsius. Os níveis de cálcio caíram rapidamente quando a temperatura foi aumentada.
Imagens de cálcio de neurônios cerebrais de moscas expressando GCaMP seis F no tempo 0,1 mostraram fluorescência em quatro dos sete neurônios, e a intensidade desses neurônios diminuiu ao longo do tempo. Na presença de octinais, múltiplos neurônios brilharam. A fluorescência de 10 neurônios aumentou simultaneamente no ponto de tempo 92, sugerindo que esses neurônios de cogumelos respondem ao odor octinal.
O TACI pode separar células sobrepostas. Nesta imagem de projeção máxima, dois neurônios sobrepostos foram identificados. Esses neurônios foram separados na visão orthro, indicando que esses neurônios apareceram em diferentes posições Z.
A célula laranja mostrou o sinal mais forte em Z sete, enquanto a célula azul teve o sinal mais forte em Z 10. A mudança na fluorescência dessas duas células e revelou a ativação tardia, mas forte, da célula laranja. Durante a extração, o valor máximo de fluorescência de todas as posições Z em que um neurônio aparece é usado para representar a intensidade do neurônio na deposição correspondente.
Ao usar o TACI para analisar um grande número de neurônios, algum registro em posições Z precisa ser incluído em uma nova função a ser desenvolvida organizada com informações de fluorescência. A TACI fornece uma abordagem computacional de código aberto e fácil de usar para análise de imagens de cápsulas 3D para verificar o movimento das células no eixo Z quando células individuais aparecem em várias posições Z.
