Во время записи кальциевой визуализации клетки движутся во всех направлениях. Было разработано множество инструментов для коррекции движения X и Y, но движение по оси Z также нуждается в явной диагностике и коррекции. TACI - это удобный плагин J с открытым исходным кодом.
Он проверяет дрейф Z и анализирует 3D-визуализацию кальция с движением во всех направлениях. После подготовки личинок мух трижды промойте их в ПБС. Пипетка 75 микролитров PBS нанесите на центр предметного стекла.
Поместите одну или две личинки в PBS и поместите микрозонд термопары рядом с личинками. Накройте личинки и микрозонд термопары стеклянной крышкой и запечатайте ее лаком для ногтей. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа.
Найдите фокус с помощью 25-кратного объектива и поместите термоэлектрический кулер на предметное стекло. В конфокальном программном обеспечении сосредоточьтесь на интересующих флуоресцентных клетках. Отрегулируйте мощность лазера, чтобы избежать перенасыщения, и установите первое и последнее положения среза в настройке Z-стека.
Одновременно запустите сканирование стека Z и запись температуры. Управляйте источником питания, который питает Пельтье, чтобы изменить температуру поверхности Пельтье. После этого остановите сканирование стека Z и запись температуры.
После загрузки точечной банки для визуализации кальция TACI установите плагин на Фиджи, щелкнув плагины в строке меню, а затем установив в раскрывающемся меню. Затем перезапустите Fiji и запустите плагин, нажав на плагины и выбрав кальциевую визуализацию TACI. Выберите функцию переименования, чтобы преобразовать имена файлов TIFF в нужную структуру.
Выберите папку, в которой изображения TIFF нужно переименовать, нажав «Обзор папок», и дождитесь автоматического заполнения имени файла, используя имя папки. проверьте максимальное положение T и максимальное положение Z. Убедитесь, что значения параметров для максимального положения T и максимального положения Z включают все цифры.
Введите положение каждого параметра по порядку. Если имена файлов TIFF не включают фразу и канал, оставьте соответствующее значение параметра пустым и выберите NA по порядку. Если есть какой-либо posttext, добавляется в параметр posttext.
Нажмите «Переименовать», чтобы создать папку с тем же именем, а затем подчеркните R.Обратите внимание, что имена файлов TIFF были реструктурированы в папке для совместимости с функцией организации. Затем используйте функцию организации, чтобы сохранить изображения TIFF в той же позиции Z в одной папке. Выберите папку, в которой нужно упорядочить T-образы, нажав кнопку «Обзор папок».
Если CSV-файл параметров существует, дождитесь автоматического заполнения значений параметров. Если CSV-файл параметров не существует, заполните значения параметров вручную. Убедитесь, что значения параметров фазы и канала включают буквы, если они присутствуют, в то время как значения параметров положения T и положения Z должны быть наибольшими числами положений T и Z.
Если имена файлов изображений не включают фазу или канал, введите NA. Затем при необходимости создайте изображения TIFF в градациях серого, убедившись, что флажок R images gray не установлен. Нажмите кнопку «Упорядочить», чтобы создать папку с тем же именем, за которым следуют стеки подчеркивания серого цвета, и создать папки с тем же именем, за которым следуют символ подчеркивания и номер позиции Z в папке. Затем обратите внимание, что файлы TIFF отсортированы по соответствующим папкам по позициям Z и что создается файл с именем param dot CSV, в котором можно найти параметры и их значения.
Теперь используйте trackmate на Фиджи для извлечения интенсивности флуоресценции интересующих клеток из каждой Z-позиции. Откройте изображения TIFF в папке позиции Z на Фиджи и запустите TRACKMATE, щелкнув плагины и выбрав отслеживание, а затем Trackmate. Отрегулируйте параметры с помощью детекторов DOG или LOG.
Измените пороговое значение диаметра больших двоичных объектов и медианный фильтр. Установите фильтры, чтобы удалить нерелевантные сигналы. Установите максимальное расстояние связывания, максимальное расстояние закрытия зазора и максимальное расстояние закрытия зазора кадра.
Экспортируйте интенсивность флуоресценции интересующих областей в CSV-файл. Для каждого нейрона создайте папку и назовите ее, используя номер нейрона. Начиная с нулевого нейрона.
Сохраните CSV-файлы, содержащие информацию о флуоресценции соответствующего нейрона, в папке. Назовите CSV-файлы как среднюю интенсивность Z, номер позиции точка CSV и включите как минимум два столбца: положение T и среднюю интенсивность или первый канал средней интенсивности. Создайте CSV-файл с точкой списка подчеркивания фона, который содержит информацию обо всех нейронах в определенном формате, начиная с нулевого нейрона.
Заполните номера нейронов, такие как ноль нейронов, в первой строке. Затем укажите интенсивность фона для каждой анализируемой позиции Z. Если четыре позиции Z анализируются для нулевого нейрона, заполните четыре значения интенсивности фона ниже нуля нейрона.
Сохраните созданный фоновый список, точечный CSV-файл и папки, содержащие CSV-файлы флуоресцентной информации, в одной папке. Откройте TACI и выберите функцию извлечения. Затем выберите папку, нажав «Обзор файлов».
Фоновый файл заполняется автоматически. Заполните наибольшее количество Т-позиций для количества Т-позиций. Нажмите кнопку «Извлечь», чтобы создать папку результатов, включающую CSV-файлы и графики каждого нейрона.
Файлы CSV включают максимальную интенсивность флуоресценции и дельту F над дельта-нулем в каждом положении T. Графики представляют собой линейные диаграммы дельты F над нулевыми позициями F и T. Используя функцию слияния, усредните дельту F над нулем F от всех нейронов.
Рассчитайте SEM и постройте среднюю дельту F над нулем F над позициями T. Выберите папку результатов, созданную функцией извлечения, щелкнув «Просмотреть файлы». Заполните количество Т-позиций наибольшим количеством Т-позиций.
Нажмите кнопку «Объединить», чтобы создать объединенную папку данных, включающую объединенный CSV-файл с подчеркнутыми данными и PNG-график со средним значением подчеркивания DF F с нулевой точкой. Файл CSV включает в себя среднее значение и информацию SEM delta F над F zero в каждой позиции T. График представляет собой линейный график средней дельты F над F ноль над T позициями.
Кальциевая визуализация холодных клеток личинок мух, экспрессирующих GCaMP шесть M, практически не показывает флуоресценции в неактивном состоянии при 27 градусах Цельсия. Однако внутриклеточный уровень кальция быстро увеличивался при 10 градусах Цельсия. Уровень кальция быстро падал при повышении температуры.
Кальциевая визуализация нейронов головного мозга мух, экспрессирующих GCaMP шесть F в момент времени 0,1, показала флуоресценцию в четырех из семи нейронов, и интенсивность этих нейронов со временем уменьшалась. В присутствии октинального несколько нейронов осветляются. Флуоресценция 10 нейронов увеличилась одновременно в момент времени 92, что позволяет предположить, что эти грибовидные нейроны реагируют на восьмилетний запах.
TACI может разделять перекрывающиеся ячейки. На этом максимальном проекционном изображении были идентифицированы два перекрывающихся нейрона. Эти нейроны были разделены в ортро-представлении, что указывает на то, что эти нейроны появились в разных Z-положениях.
Оранжевая ячейка показала самый сильный сигнал на Z семь, в то время как синяя ячейка имела самый сильный сигнал на Z 10. Изменение флуоресценции этих двух клеток и выявило замедленную, но сильную активацию оранжевой клетки. Во время экстракции максимальное значение флуоресценции из всех позиций Z, в которых появляется нейрон, используется для представления интенсивности нейрона при соответствующем осаждении.
При использовании TACI для анализа большого количества нейронов некоторая регистрация в Z-позициях должна быть включена в новую функцию, которая должна быть разработана, организованная с помощью флуоресцентной информации. TACI предоставляет удобный вычислительный подход с открытым исходным кодом для анализа 3D-капсул для проверки движения клеток по оси Z, когда отдельные клетки появляются в нескольких положениях Z.
