Durante el registro de imágenes de calcio, las células se mueven en todas las direcciones. Se han desarrollado muchas herramientas para corregir el movimiento X e Y, pero el movimiento en el eje Z también necesita ser diagnosticado y corregido explícitamente. TACI es un plug-in J de imagen de código abierto fácil de usar.
Comprueba la deriva Z y analiza las imágenes 3D de calcio con movimiento en todas las direcciones. Después de preparar las larvas de mosca, enjuáguelas en PBS tres veces. Pipetear 75 microlitros de PBS en el centro de un portaobjetos de vidrio.
Coloque una o dos larvas en PBS y coloque el termopar micrprobe cerca de las larvas. Cubra las larvas y la microsonda del termopar con un resbalón de cubierta de vidrio y séllelo con esmalte de uñas. Coloque el portaobjetos en la plataforma del microscopio.
Encuentra el enfoque usando un objetivo de 25 veces y coloca el enfriador termoeléctrico en el portaobjetos. En el software confocal, concéntrese en las células fluorescentes de interés. Ajuste la potencia del láser para evitar la sobresaturación y establezca las posiciones de la primera y la última división en la configuración de la pila Z.
Simultáneamente, inicie el escaneo de la pila Z y el registro de temperatura. Controle la fuente de alimentación que alimenta el Peltier para cambiar la temperatura de la superficie del Peltier. Luego, detenga el escaneo de la pila Z y el registro de temperatura.
Después de descargar el tarro de puntos de imágenes de calcio TACI, instale el complemento en Fiji haciendo clic en complementos en la barra de menú, seguido de instalar en el menú desplegable. Luego reinicie Fiji y ejecute el complemento haciendo clic en los complementos y eligiendo imágenes de calcio TACI. Elija la función de cambio de nombre para convertir los nombres de archivo TIFF a la estructura requerida.
Elija la carpeta en la que las imágenes TIFF necesitan cambiar el nombre haciendo clic en examinar carpetas y espere a que el nombre del archivo se complete automáticamente Usando el nombre de carpeta. compruebe la posición T máxima y la posición Z máxima. Asegúrese de que los valores de los parámetros para la posición T máxima y la posición Z máxima incluyan todos los dígitos.
Introduzca la posición de cada parámetro en orden. Si los nombres de archivo TIFF no incluyen la frase y el canal, deje el valor del parámetro correspondiente en blanco y elija NA en orden. Si hay algún posttext, agréguelo al parámetro posttext.
Haga clic en cambiar nombre para crear una carpeta con el mismo nombre, seguido de un guión bajo R.Observe que los nombres de archivo TIFF se han reestructurado en la carpeta para que sean compatibles con la función organizar. A continuación, utilice la función de organización para guardar las imágenes TIFF en la misma posición Z en una carpeta. Elija la carpeta en la que las imágenes T necesitan organizarse haciendo clic en examinar carpetas.
Si el archivo CSV de parámetros existe, espere a que los valores de los parámetros se rellenen automáticamente. Si el archivo CSV de parámetros no existe, rellene manualmente los valores de los parámetros. Asegúrese de que los valores de los parámetros de fase y canal incluyan letras si están presentes, mientras que los valores de parámetro de la posición T y la posición Z deben ser los números más grandes de las posiciones T y Z.
Si los nombres de archivo de imagen no incluyen la fase o el canal, introduzca NA. A continuación, cree imágenes TIFF en escala de grises cuando sea necesario asegurándose de que la casilla R imágenes grises no esté marcada. Haga clic en organizar para crear una carpeta con el mismo nombre seguido de pilas de subrayado gris y para generar carpetas con el mismo nombre seguido de carácter de subrayado y el número de posición Z en la carpeta. Luego observe que los archivos TIFF se ordenan en carpetas correspondientes por posiciones Z, y que se genera un archivo llamado param dot CSV en el que se pueden encontrar los parámetros y sus valores.
Ahora use trackmate en Fiji para extraer las intensidades de fluorescencia de las células de interés de cada posición Z. Abra las imágenes TIFF en una carpeta de posición Z de Fiji y ejecute TRACKMATE haciendo clic en complementos y seleccionando seguimiento, seguido de Trackmate. Ajuste los parámetros utilizando detectores DOG o LOG.
Cambie el umbral de diámetro de blob y el filtro mediano. Establezca los filtros para eliminar las señales irrelevantes. Establezca la distancia máxima de enlace, la distancia máxima de cierre de espacio y el espacio de cierre de fotogramas máximo.
Exporte las intensidades de fluorescencia de las regiones de interés a un archivo CSV. Para cada neurona, cree una carpeta y asígnele un nombre usando el número de neurona. Partiendo de la neurona cero.
Guarde los archivos CSV que contienen la información de fluorescencia de la neurona correspondiente en la carpeta. Asigne a los archivos CSV el nombre de intensidad media Z position number dot CSV e incluya al menos dos columnas, posición T e intensidad media, o canal de intensidad media uno. Cree el archivo CSV de la lista de subrayados de fondo que contiene la información de todas las neuronas en un formato específico, comenzando desde la neurona cero.
Complete los números de neurona, como la neurona cero, en la fila uno. Luego proporcione la intensidad de fondo para cada posición Z analizada. Si se analizan cuatro posiciones Z para la neurona cero, complete cuatro valores de intensidad de fondo por debajo de la neurona cero.
Guarde el archivo CSV de la lista en segundo plano creado y las carpetas que contienen los archivos CSV de la información de fluorescencia en una carpeta. Abra TACI y elija la función de extracción. Luego elija la carpeta haciendo clic en examinar archivos.
El archivo de fondo se rellena automáticamente. Complete el mayor número de posiciones T para el número de posiciones T. Haga clic en extraer para crear una carpeta de resultados que incluya los archivos CSV y gráficos de cada neurona.
Los archivos CSV incluyen la intensidad máxima de fluorescencia y delta F sobre delta cero en cada posición T. Los gráficos son gráficos de líneas de delta F sobre F cero versus posiciones T. Usando la función de fusión, promedie el delta F sobre F cero de todas las neuronas.
Calcule el SEM y trace el delta promedio F sobre F cero sobre las posiciones T. Elija la carpeta de resultados creada por la función de extracción haciendo clic en examinar archivos. Complete el número de posiciones T con el mayor número de posiciones T.
Haga clic en combinar para crear una carpeta de datos combinados, incluido un archivo CSV de datos subrayados combinados y un gráfico PNG de subrayado DF de subrayado promedio F cero puntos. El archivo CSV incluye la información promedio y delta SEM F sobre F cero en cada posición T. El gráfico es un gráfico lineal del delta promedio F sobre F cero sobre las posiciones T.
Las imágenes de calcio de células frías larvales de mosca que expresan GCaMP seis M apenas muestran fluorescencia en estado inactivo a 27 grados centígrados. Sin embargo, los niveles de calcio intracelular aumentaron rápidamente a 10 grados centígrados. Los niveles de calcio disminuyeron rápidamente cuando se aumentó la temperatura.
Las imágenes de calcio de las neuronas cerebrales de mosca que expresan GCaMP seis F en el momento 0.1 mostraron fluorescencia en cuatro de las siete neuronas, y la intensidad de estas neuronas disminuyó con el tiempo. En presencia de octinal, múltiples neuronas se iluminaron. La fluorescencia de 10 neuronas aumentó simultáneamente en el punto de tiempo 92, lo que sugiere que estas neuronas de hongos responden al olor octinal.
TACI puede separar células superpuestas. En esta imagen de proyección máxima, se identificaron dos neuronas superpuestas. Estas neuronas se separaron en la vista de ortro, lo que indica que estas neuronas aparecieron en diferentes posiciones Z.
La celda naranja mostró la señal más fuerte en Z siete, mientras que la celda azul tenía la señal más fuerte en Z 10. El cambio en la fluorescencia de estas dos células y reveló la activación retardada pero fuerte de la célula naranja. Durante la extracción, el valor máximo de fluorescencia de todas las posiciones Z en las que aparece una neurona se utiliza para representar la intensidad de la neurona en la deposición correspondiente.
Si se utiliza TACI para analizar un gran número de neuronas, es necesario incluir algún registro a través de las posiciones Z en una nueva función que se desarrollará organizada con información de fluorescencia. TACI proporciona un enfoque computacional de código abierto fácil de usar para el análisis de imágenes de cápsulas 3D para verificar el movimiento celular en el eje Z cuando las células individuales aparecen en múltiples posiciones Z.
