칼슘 이미징 기록 중에 세포는 모든 방향으로 움직입니다. X 및 Y 모션을 수정하기 위해 많은 도구가 개발되었지만 Z축의 모션도 명시적으로 진단하고 수정해야 합니다. TACI는 사용자 친화적인 오픈 소스 이미지 J 플러그인입니다.
Z 드리프트를 확인하고 모든 방향의 움직임으로 3D 칼슘 이미징을 분석합니다. 파리 유충을 준비한 후 PBS에서 세 번 헹굽니다. 75마이크로리터의 PBS를 유리 슬라이드 중앙에 피펫팅합니다.
PBS에 하나 또는 두 개의 유충을 넣고 유충 근처에 열전대 micrprobe를 놓습니다. 유충과 열전대 마이크로 프로브를 유리 덮개 슬립으로 덮고 매니큐어로 밀봉하십시오. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다.
25배 대물렌즈를 사용하여 초점을 찾고 슬라이드에 열전 냉각기를 놓습니다. 컨포칼 소프트웨어에서는 관심 있는 형광 셀에 초점을 맞춥니다. 과포화를 방지하기 위해 레이저 출력을 조정하고 Z 스택 설정에서 첫 번째 및 마지막 슬라이스 위치를 설정합니다.
동시에 Z 스택 스캐닝 및 온도 기록을 시작합니다. Peltier에 전원을 공급하는 전원 공급 장치를 제어하여 Peltier의 표면 온도를 변경합니다. 그런 다음 Z 스택 스캔 및 온도 기록을 중지합니다.
TACI 칼슘 이미징 도트 항아리를 다운로드한 후 메뉴 표시줄에서 플러그인을 클릭한 다음 드롭다운 메뉴에서 설치를 클릭하여 피지에 플러그인을 설치합니다. 그런 다음 피지를 다시 시작하고 플러그인을 클릭하고 TACI 칼슘 이미징을 선택하여 플러그인을 실행합니다. TIFF 파일 이름을 필요한 구조로 변환하려면 이름 바꾸기 기능을 선택합니다.
폴더 찾아보기를 클릭하여 TIFF 이미지의 이름을 바꿔야 하는 폴더를 선택하고 폴더 이름을 사용하여 파일 이름이 자동으로 채워질 때까지 기다립니다. 최대 T 위치와 최대 Z 위치를 확인하십시오. 최대 T 위치 및 최대 Z 위치에 대한 매개 변수 값에 모든 숫자가 포함되어 있는지 확인합니다.
각 매개변수의 위치를 순서대로 입력합니다. TIFF 파일 이름에 구와 채널이 포함되어 있지 않으면 해당 매개 변수 값을 비워 두고 순서대로 NA를 선택합니다. posttext가 있는 경우 posttext 매개 변수에 추가합니다.
이름 바꾸기를 클릭하여 같은 이름의 폴더를 만들고 그 뒤에 밑줄 R을 누릅니다. TIFF 파일 이름이 구성 기능과 호환되도록 폴더에서 재구성되었는지 확인합니다. 그런 다음 구성 기능을 사용하여 TIFF 이미지를 한 폴더의 동일한 Z 위치에 저장합니다. 폴더 찾아보기를 클릭하여 T 이미지를 구성해야 하는 폴더를 선택합니다.
매개 변수 CSV 파일이 있는 경우 매개 변수 값이 자동으로 채워질 때까지 기다립니다. 매개 변수 CSV 파일이 없는 경우 매개 변수 값을 수동으로 입력합니다. 위상 및 채널의 매개변수 값(있는 경우)에 문자가 포함되어 있는지 확인하고, T 위치 및 Z 위치의 매개변수 값은 T 및 Z 위치 중 가장 큰 수여야 합니다.
이미지 파일 이름에 위상 또는 채널이 포함되어 있지 않으면 NA를 입력합니다. 그런 다음 R 이미지 회색 상자가 선택 취소되어 있는지 확인하여 필요할 때 그레이 스케일 TIFF 이미지를 만듭니다. 구성을 클릭하여 같은 이름의 폴더와 밑줄 뒤에 밑줄 회색 밑줄 스택이 있는 폴더를 만들고, 폴더에 같은 이름 뒤에 밑줄과 Z 위치 번호가 오는 폴더를 생성합니다. 그런 다음 TIFF 파일이 Z 위치별로 해당 폴더로 정렬되고 매개 변수와 해당 값을 찾을 수 있는 param dot CSV라는 파일이 생성되는지 확인합니다.
이제 피지에서 trackmate를 사용하여 각 Z 위치에서 관심 세포의 형광 강도를 추출합니다. Fiji의 Z 위치 폴더에서 TIFF 이미지를 열고 플러그인을 클릭하고 추적을 선택한 다음 Trackmate를 선택하여 TRACKMATE를 실행합니다. DOG 또는 LOG 감지기를 사용하여 매개변수를 조정합니다.
Blob 지름 임계값 및 중앙값 필터를 변경합니다. 관련 없는 신호를 제거하도록 필터를 설정합니다. 연결 최대 거리, 갭 닫힘 최대 거리 및 갭 닫힘 최대 프레임 간격을 설정합니다.
관심 영역의 형광 강도를 CSV 파일로 내보냅니다. 각 뉴런에 대해 폴더를 만들고 뉴런 번호를 사용하여 이름을 지정합니다. 뉴런 제로에서 시작합니다.
해당 뉴런의 형광 정보가 포함된 CSV 파일을 폴더에 저장합니다. CSV 파일의 이름을 평균 강도 Z 위치 번호 점 CSV로 지정하고 위치 T와 평균 강도 또는 평균 강도 채널 1의 두 개 이상의 열을 포함합니다. 뉴런 0부터 시작하여 특정 형식의 모든 뉴런 정보가 포함된 배경 밑줄 목록 점 CSV 파일을 만듭니다.
1행의 뉴런 0과 같은 뉴런 번호를 입력합니다. 그런 다음 분석된 각 Z 위치에 대한 배경 강도를 제공합니다. 4개의 Z 위치가 뉴런 0에 대해 분석되는 경우 뉴런 0 아래에 4개의 배경 강도 값을 채웁니다.
생성된 배경 목록 도트 CSV 파일과 형광 정보의 CSV 파일이 포함된 폴더를 하나의 폴더에 저장합니다. TACI를 열고 추출 기능을 선택합니다. 그런 다음 파일 찾아보기를 클릭하여 폴더를 선택합니다.
백그라운드 파일이 자동으로 채워집니다. T 위치 수에 대해 가장 많은 수의 T 위치를 채웁니다. 추출을 클릭하여 각 뉴런의 CSV 파일과 플롯이 포함된 결과 폴더를 만듭니다.
CSV 파일에는 최대 형광 강도와 각 T 위치에서 델타 0에 대한 델타 F가 포함됩니다. 플롯은 F 0 대 T 위치에 대한 델타 F의 꺾은선형 차트입니다. merge 함수를 사용하여 모든 뉴런에서 델타 F를 F 0에 대한 평균을 구합니다.
SEM을 계산하고 T 위치에 대해 F 0에 대한 평균 델타 F를 플로팅합니다. 파일 찾아보기를 클릭하여 추출 함수로 만든 결과 폴더를 선택합니다. T 위치 수가 가장 많은 T 위치 수를 채웁니다.
병합을 클릭하여 병합된 밑줄이 그어진 데이터 CSV 파일과 평균 밑줄 DF 밑줄 F 제로 도트 PNG 플롯을 포함하여 병합된 데이터 폴더를 만듭니다. CSV 파일에는 각 T 위치에서 평균 및 SEM 델타 F over F 0 정보가 포함됩니다. 이 그림은 T 위치에 대한 F 0에 대한 평균 델타 F의 꺾은선형 차트입니다.
GCaMP six M을 발현하는 파리 유충 냉각 세포의 칼슘 이미징은 섭씨 27도에서 비활성 상태의 형광을 거의 나타내지 않습니다. 그러나 세포 내 칼슘 수치는 섭씨 10도에서 급격히 증가했습니다. 온도가 상승하면 칼슘 수치가 급격히 떨어졌습니다.
시간 0.1에서 GCaMP 6F를 발현하는 파리 뇌 뉴런의 칼슘 이미징은 7개의 뉴런 중 4개에서 형광을 보였으며 이러한 뉴런의 강도는 시간이 지남에 따라 감소했습니다. octinal의 존재에서, 다수 뉴런은 밝아졌다. 10개 뉴런의 형광은 92번 시점에서 동시에 증가했으며, 이는 이들 버섯 뉴런이 옥티날 냄새에 반응한다는 것을 시사합니다.
TACI는 겹치는 셀을 분리할 수 있습니다. 이 최대 투영 이미지에서 두 개의 겹치는 뉴런이 확인되었습니다. 이 뉴런은 orthro 보기에서 분리되어 이 뉴런이 다른 Z 위치에 나타났음을 나타냅니다.
주황색 셀은 Z 7에서 가장 강한 신호를 보였고 파란색 셀은 Z 10에서 가장 강한 신호를 보였습니다. 이 두 세포의 형광 변화는 오렌지 세포의 지연되지만 강력한 활성화를 밝혀 주었다. 추출하는 동안 뉴런이 나타나는 모든 Z 위치의 최대 형광 값은 해당 증착에서 뉴런의 강도를 나타내는 데 사용됩니다.
TACI를 사용하여 많은 수의 뉴런을 분석하는 경우, Z 위치에 대한 일부 정합은 형광 정보로 구성된 새로운 기능을 개발하기 위해 포함되어야 합니다. TACI는 3D 캡슐 이미징 분석을 위한 사용자 친화적인 오픈 소스 계산 접근 방식을 제공하여 개별 세포가 여러 Z 위치에 나타날 때 Z축에서 세포 움직임을 확인합니다.
