在钙成像记录期间，细胞向各个方向移动。已经开发了许多工具来校正X和Y运动，但是Z轴上的运动也需要明确诊断和校正。TACI 是一个用户友好的开源镜像 J 插件。
它检查Z轴漂移并分析具有所有方向运动的3D钙成像。准备好苍蝇幼虫后，在PBS中冲洗三次。将75微升PBS移液到载玻片的中心。
将一个或两个幼虫放入PBS中，并将热电偶云母探针放在幼虫附近。用玻璃盖玻片盖住幼虫和热电偶微探针，并用指甲油密封。将载玻片放在显微镜载物台上。
使用25倍物镜找到焦点，并将热电冷却器放在载玻片上。在共聚焦软件中，专注于感兴趣的荧光细胞。调整激光功率以避免过饱和，并在Z堆栈设置中设置第一个和最后一个切片位置。
同时，开始Z堆栈扫描和温度记录。控制为帕尔贴供电的电源以改变帕尔贴的表面温度。之后，停止Z堆栈扫描和温度记录。
下载 TACI 钙成像点罐后，通过单击菜单栏中的插件在斐济安装插件，然后在下拉菜单中安装。然后重新启动斐济并通过单击插件并选择 TACI 钙成像来运行插件。选择重命名函数以将 TIFF 文件名转换为所需的结构。
通过单击浏览文件夹来选择需要重命名 TIFF 图像的文件夹，然后等待文件名自动填充 使用文件夹名称。检查最大 T 位置和最大 Z 位置。确保最大 T 位置和最大 Z 位置的参数值包括所有数字。
按顺序输入每个参数的位置。如果 TIFF 文件名不包含短语和通道，请将相应的参数值留空，然后按顺序选择 NA。如果有任何帖子，则添加到 posttext 参数中。
单击“重命名”以创建具有相同名称的文件夹，后跟下划线 R。请注意，该文件夹中的 TIFF 文件名是否已重组，以便与组织功能兼容。接下来，使用组织功能将TIFF图像保存在一个文件夹中的相同Z位置。通过单击浏览文件夹来选择需要组织 T 图像的文件夹。
如果参数 CSV 文件存在，请等待参数值自动填充。如果参数 CSV 文件不存在，请手动填写参数值。确保相位和通道的参数值包括字母（如果存在），而T位置和Z位置的参数值应为T和Z位置的最大数。
如果图像文件名不包含相位或通道，请输入 NA。然后，通过确保未选中灰色框 R 图像，在需要时创建灰度 TIFF 图像。单击“组织”以创建具有相同名称的文件夹，后跟下划线灰色下划线堆栈，并在文件夹中生成具有相同名称后跟下划线和 Z 位置编号的文件夹。然后观察 TIFF 文件按 Z 位置分类到相应的文件夹中，并生成一个名为 param dot CSV 的文件，其中可以找到参数及其值。
现在使用斐济的轨迹从每个Z位置提取感兴趣细胞的荧光强度。在斐济的 Z 位置文件夹中打开 TIFF 图像，然后通过单击插件并选择跟踪来运行 TRACKMATE，然后选择跟踪。使用 DOG 或 LOG 检测器调整参数。
更改 blob 直径阈值和中值筛选器。设置过滤器以删除不相关的信号。设置链接最大距离、间隙闭合最大距离和间隙闭合最大帧间距。
将感兴趣区域的荧光强度导出到 CSV 文件。对于每个神经元，创建一个文件夹并使用神经元编号命名。从神经元零开始。
将包含相应神经元荧光信息的CSV文件保存在文件夹中。将 CSV 文件命名为平均强度 Z 位置编号点 CSV，并包括至少两列、位置 T 和平均强度或平均强度通道 1。创建背景下划线列表点 CSV 文件，其中包含特定格式的所有神经元的信息，从神经元零开始。
填写神经元编号，例如第一行中的神经元零。然后提供分析的每个 Z 位置的背景强度。如果分析神经元零的四个 Z 位置，请填写神经元零以下的四个背景强度值。
将创建的背景列表点CSV文件和包含荧光信息的CSV文件的文件夹保存在一个文件夹中。打开 TACI 并选择提取功能。然后通过单击浏览文件来选择文件夹。
后台文件会自动填充。为 T 仓数填写最大数量的 T 仓位。单击“提取”以创建包含每个神经元的 CSV 文件和绘图的结果文件夹。
CSV 文件包括最大荧光强度，以及每个 T 位置的 delta F 与 delta 零点的关系。这些图是 F 零与 T 位置上的 delta F 折线图。使用合并函数，将所有神经元的 delta F 平均在 F 零上。
计算 SEM 并绘制 F 零在 T 位置上的平均 delta F。通过单击浏览文件选择提取功能创建的结果文件夹。填写 T 仓数最多的 T 仓数。
单击合并以创建合并的数据文件夹，包括合并的下划线数据 CSV 文件和平均下划线 DF 下划线 F 零点 PNG 图。CSV 文件包括每个 T 位置的平均值和 F 零点上的 SEM 增量 F 信息。该图是 F 零 T 位置上平均 delta F 的折线图。
表达GCaMP six M的苍蝇幼虫冷细胞的钙成像在27摄氏度下几乎不显示任何非活性状态的荧光。然而，细胞内钙水平在10摄氏度时迅速增加。当温度升高时，钙水平迅速下降。
在时间0.1表达GCaMP six F的苍蝇脑神经元的钙成像显示，七个神经元中的四个神经元具有荧光，并且这些神经元的强度随时间而降低。在八天体的存在下，多个神经元变亮。10个神经元的荧光在时间点92同时增加，表明这些蘑菇神经元对异味有反应。
TACI可以分离重叠的单元格。在这个最大投影图像中，确定了两个重叠的神经元。这些神经元在orthro视图中被分离，表明这些神经元出现在不同的Z位置。
橙色细胞在Z 7上显示最强的信号，而蓝色细胞在Z 10上显示最强的信号。这两个细胞的荧光变化揭示了橙色细胞的延迟但强烈的激活。在提取过程中，神经元出现的所有Z位置的最大荧光值用于表示神经元在相应沉积时的强度。
如果使用TACI分析大量神经元，则需要在要开发的新功能中包含跨Z位置的一些注册，该函数由荧光信息组织。TACI为3D胶囊成像分析提供了一种用户友好的开源计算方法，当单个细胞出现在多个Z位置时，可以检查Z轴上的细胞运动。
