פרוטוקול זה מתמקד בכימות נשימה מיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים, כמו גם תאי HL60 דמויי נויטרופילים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי. שיטה זו מאפשרת לנו לכמת את תפקוד המיטוכונדריה בנויטרופילים בתנאים נורמליים ובתנאי מחלה. זוהי טכניקה פשוטה שיכולה לספק תובנות לגבי תפקוד המיטוכונדריה של התאים בתגובה לתרופות או לכל מצב מחלה.
מכיוון שלתאים שונים יש יעילות נשימתית מיטוכונדריאלית שונה, אופטימיזציה של צפיפות זריעת התאים וריכוז הריאגנט צריכה להתבצע במדויק כדי לקבל תוצאות באיכות גבוהה. כדי להתחיל את בדיקת השטף החוץ-תאי המטבולי, קח מחסנית חיישן ארוזה מעל צלחת 96 בארות שתוכננה במיוחד והעבר 200 מיקרוליטר של מדיום כיול לכל באר של הצלחת שמתחתיה. הרימו בזהירות את המחסנית ואת הצלחת עם כיול, והניחו אותם באינקובטור לחות של 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני למשך הלילה ללחות.
לאחר מכן, בהתאם לסוג התא, צפו את הצלחת בת 96 הבארות בציפוי ספציפי כדי להבטיח הידבקות התא. לאחר מכן, לשטוף את הצלחות עם 200 מיקרוליטר של PBS סטרילי פעמיים. הכן את מדיום הבדיקה ב- DMEM עם פירובט מילימולרי אחד, גלוקוז 10 מילימולרי וגלוטמין שני מילימולרי.
לרכוש את העכבר ואת תאי הנויטרופילים האנושיים כמתואר בכתב היד של הטקסט. עבור נויטרופילים שנרכשו מהעכבר, התאם את צפיפות התא ל -1.1 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר על ידי הוספת מדיום בדיקה. ואז זרעו 180 מיקרוליטר של השעיית נויטרופילים עכבר לכל באר לתוך צלחת מוכן 96 באר.
באופן דומה, התאימו את צפיפות תאי הנויטרופילים האנושיים ל-2.2 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר באמצעות מדיום הבדיקה. ביום הבדיקה, ספור את תאי HL60 דמויי נויטרופילים באופן ידני באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן צנטריפוגו את תאי HL60 המוזכרים או הבלתי ממוינים ב-300G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
לשטוף את התאים עם DMEM פעם אחת ולהשעות אותם מחדש במדיום הבדיקה כדי להשיג צפיפות תאים של 1.39 פעמים 10 עד התאים השישי למיליליטר. לאחר מכן זרעו 180 מיקרוליטר של תאי HL60 ממוינים או לא ממוינים לתוך צלחת 96 בארות מוכנה מראש המכילה את העכבר ואת דגימות נויטרופילים אנושיים. לבסוף, הוסיפו תווך שלם לבארות הפינתיות של צלחת תרבית התא נטולות התאים לתיקון רקע בזמן הזריעה.
צנטריפוגו את הצלחת ב-300 גרם בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות ללא הפסקה כדי להבטיח היצמדות תקינה של התאים בתחתית הצלחת. לבסוף, לדגור על הצלחת במשך שעה אחת כדי לאזן מראש את התאים עם מדיום המבחן. פתח את ערכת בדיקת המאמץ המיטוכונדריאלי והכן את הריאגנטים בהתאם להוראות היצרן.
לאחר מכן, טען את המחסנית בריאגנטים, החל מהאוליגומיצין המוכן ליציאה A, FCCP ליציאה B, ותערובת רוטנון/אנטימיצין A ליציאה C להזרקות. מלא את היציאות שאינן בשימוש עם 20 מיקרוליטר של מדיום המבחן. אזנו את מערכת הבדיקה ב-37 מעלות צלזיוס לפחות חמש שעות לפני הבדיקה על ידי פתיחת תוכנת Wave ולחיצה על הכרטיסייה Heater On.
לאחר ההגעה לטמפרטורה, הפינה השמאלית התחתונה של תוכנת Wave מראה מוכן. פתח תבנית עבור ערכת בדיקת המאמץ המיטוכונדריאלי בתוכנה. בחר אסטרטגיות הזרקה בצד שמאל ולאחר מכן לחץ על הוסף ותן שם למצב ההזרקה כנויטרופילים אנושיים או נויטרופילים של עכבר או HL60.
בחר יציאה A ל- D על ידי לחיצה על כל אחד מהם, ולחץ על הוסף תרכובת והזן אוליגומיצין או FCCP או רוטנון/אנטימיצין A עם הריכוזים המתאימים. בחר Pretreatment בצד שמאל ולאחר מכן לחץ על הוסף ותן להם את השם CD18 ו- Cell Tak בנפרד. בחר את סוג התא בצד ימין.
לאחר מכן לחץ על הוסף ותן להם שם נויטרופילים אנושיים, נויטרופילים של עכבר ו- HL60 או DHL60 עם צפיפות הזנה לפי הצורך. הגדר את הקבוצות על ידי לחיצה על הוסף קבוצה. לאחר מכן לחץ על ההגדרה המסומנת בקו תחתון.
לחץ על מפת לוחות בתפריט העליון כדי לצפות בכל הקבוצות עם הגדרות בצד שמאל ומפת הלוחות בצד ימין. גרור ושחרר כדי להוסיף כל באר לקבוצה תוך שמירה על ארבע הבארות הפינתיות כרקע. כדי להגדיר את הפרוטוקול, בחר בכרטיסייה פרוטוקול בתפריט העליון, והגדר שלושה מחזורים של תערובת קו בסיס, אוליגומיצין, FCCP, רוטנון ואנטימיצין A, על-ידי הגדרת הזמן לערבוב כשלוש דקות, מנוחה כאפס דקות ומדידה כשבע דקות.
עבור אל הדף Run Assay, ספק את מידע הערסל של הפרוייקט לעיון, ולחץ על Start Run. ציין את המיקום לשמירת הקבצים כך שכל התוצאות יישמרו לאחר השלמת הבדיקה. לאחר מכן לחץ על התחל הפעלה שוב.
לאחר הטעינה האוטומטית של הבדיקה, המתן לפתיחת המגש כדי למקם את מחסנית החיישן ואת הצלחת עם 200 מיקרוליטר של כיול. הגדר את כיוון ברקוד המחסנית הפונה ימינה. הפעל את הכיול על-ידי לחיצה על אני מוכן, פעולה שנמשכת כ- 20 דקות.
לאחר הכיול, לחץ על פתח מגש, החלף את הצלחת בצלחת זרעי התא ולחץ על אני מוכן להמשיך את הבדיקה. לאחר השלמת הבדיקה, הנתונים נשמרים באופן אוטומטי. יצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני או לקובץ תוכנת ניתוח אחר.
התווה את הגרף ונתח את הנתונים. הדינמיקה המייצגת של קצב צריכת החמצן או OCR הצביעה על שינויים בנשימה המיטוכונדריאלית בעכברים ובנויטרופילים אנושיים, כמו גם בתאי HL60 לא ממוינים ומובחנים בתגובה לאוליגומיצין, FCCP והתערובת של רוטנון ואנטימיצין A. ערכי OCR ירדו בכל התאים לאחר טיפול באוליגומיצין עקב עיכוב תעלת הפרוטונים של ATP סינתאז. טיפול FCCP הגביר את זרימת האלקטרונים ואת צריכת החמצן כדי להחזיר את ערך OCR ולהשיג נשימה מקסימלית.
תערובת של רוטנון ואנטימיצין A חסמה קומפלקסים 1 ו-3 בשרשרת הובלת האלקטרונים, מה שהוביל לחיסול הנשימה המיטוכונדריאלית. ירידה בנשימה המיטוכונדריאלית נצפתה בתאי HL60 לאחר התמיינות מכוונת נויטרופילים. תאי HL60 ממוינים נמצאו כבעלי נשימה מיטוכונדריאלית בסיסית נמוכה באופן משמעותי, נשימה המקושרת לדליפה של פרוטונים, נשימה הקשורה ל-ATP ונשימה שאינה מיטוכונדריאלית.
הגידול בנשימה המרבית של תאי HL60 ממוינים לא היה משמעותי, בעוד יכולת הנשימה הרזרבית גדלה באופן משמעותי. ודא שהתאים נמצאים בתחתית הצלחת, מכיוון שלמחסנית החיישן לא אמורים להיות מכשולים עקב התאים הצפים בעת קריאת ערך זיהוי התווים האופטי (OCR). טכניקה זו תסייע לחוקרים לחקור את ההשפעה של תרופות או תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במחקרים הקשורים לנויטרופילים.
