Questo protocollo si concentra sulla quantificazione della respirazione mitocondriale dei neutrofili di topo e umani, nonché delle cellule HL60 simili ai neutrofili utilizzando l'analizzatore del flusso extracellulare metabolico. Questo metodo ci consente di quantificare la funzione mitocondriale nei neutrofili in condizioni normali e di malattia. Questa è una tecnica semplice che può fornire informazioni sulla funzione mitocondriale delle cellule in risposta a farmaci o qualsiasi condizione di malattia.
Poiché cellule diverse hanno un'efficienza respiratoria mitocondriale diversa, l'ottimizzazione della densità di semina cellulare e della concentrazione del reagente deve essere eseguita con precisione per ottenere risultati di alta qualità. Per iniziare il test del flusso metabolico extracellulare, prendere una cartuccia del sensore imballata su una piastra da 96 pozzetti appositamente progettata e trasferire 200 microlitri di mezzo di calibrazione in ciascun pozzetto della piastra sottostante. Sollevare con cautela la cartuccia e la piastra con calibrante e posizionarla in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius non ad anidride carbonica durante la notte per l'idratazione.
Successivamente, in base al tipo di cella, rivestire la piastra a 96 pozzetti con un rivestimento specifico per garantire l'adesione della cella. Successivamente, lavare le piastre con 200 microlitri di PBS sterile due volte. Preparare il mezzo di analisi in DMEM con un piruvato millimolare, glucosio 10 millimolare e due glutammina millimolare.
Procurarsi le cellule dei neutrofili umani e del topo come descritto nel manoscritto testuale. Per i neutrofili acquistati dal topo, regolare la densità cellulare a 1,1 volte 10 alla sesta cellula per millilitro aggiungendo il mezzo di analisi. Quindi seminare 180 microlitri della sospensione di neutrofili del topo per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti preparata.
Allo stesso modo, regolare la densità delle cellule neutrofile umane a 2,2 volte 10 alle sesta cellule per millilitro utilizzando il mezzo di analisi. Il giorno del test, contare manualmente le cellule HL60 simili ai neutrofili utilizzando l'emocitometro. Quindi centrifugare le celle HL60 differenziate o indifferenziate a 300G a temperatura ambiente per cinque minuti.
Lavare le cellule con DMEM una volta e risospenderle nel mezzo di analisi per ottenere una densità cellulare di 1,39 volte 10 alla sesta cellula per millilitro. Successivamente seminare 180 microlitri di cellule HL60 differenziate o indifferenziate nella piastra a 96 pozzetti pre-preparata contenente i campioni di neutrofili umani e di topo. Infine, aggiungere un mezzo completo ai pozzetti angolari della piastra di coltura cellulare privo di cellule per la correzione dello sfondo durante la semina.
Centrifugare la piastra a 300G a temperatura ambiente per tre minuti senza interruzioni per garantire la corretta aderenza delle cellule sul fondo della piastra. Infine, incubare la piastra per un'ora per pre-equilibrare le cellule con il mezzo di analisi. Aprire il kit di test da sforzo mitocondriale e preparare i reagenti secondo le istruzioni del produttore.
Quindi, caricare la cartuccia con i reagenti, iniziando con l'oligomicina preparata nella porta A, FCCP nella porta B e la miscela di rotenone / antimicina A nella porta C per le iniezioni. Riempire le porte inutilizzate con 20 microlitri di terreno di analisi. Equilibrare il sistema di analisi a 37 gradi Celsius almeno cinque ore prima del test aprendo il software Wave e facendo clic sulla scheda Riscaldatore acceso.
Dopo aver raggiunto la temperatura, l'angolo in basso a sinistra del software Wave mostra pronto. Aprire un modello per il kit di analisi dello stress mitocondriale nel software. Selezionare le strategie di iniezione sul lato sinistro, quindi fare clic su Aggiungi e denominare la condizione di iniezione come neutrofili umani o neutrofili di topo o HL60.
Selezionare le porte da A a D facendo clic su ciascuna, quindi fare clic su Aggiungi composto e immettere oligomicina o FCCP o rotenone / antimicina A con le rispettive concentrazioni. Selezionare Pretrattamento sul lato sinistro, quindi fare clic su Aggiungi e denominarli CD18 e Cell Tak separatamente. Selezionare il Tipo di cella sul lato sinistro.
Quindi fare clic su Aggiungi e denominarli neutrofili umani, neutrofili di topo e HL60 o DHL60 con una densità di alimentazione applicabile. Definisci i gruppi facendo clic su Aggiungi gruppo. Quindi fare clic sulla definizione sottolineata.
Clicca su Mappa delle piastre nel menu in alto per osservare tutti i gruppi con le definizioni sul lato sinistro e la mappa delle lastre sulla destra. Trascinate e rilasciate per aggiungere ogni pozzetto al gruppo mantenendo i quattro pozzetti angolari come sfondo. Per impostare il protocollo, selezionare la scheda Protocollo nel menu in alto e definire tre cicli di miscela basale, oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina A, impostando il tempo di miscelazione come tre minuti, il riposo come zero minuti e la misurazione come sette minuti.
Passare alla pagina Esegui analisi, fornire le informazioni di riepilogo del progetto come riferimento e fare clic su Avvia esecuzione. Indicare la posizione in cui salvare i file in modo che tutti i risultati vengano salvati dopo il completamento del test. Quindi fare nuovamente clic su Avvia esecuzione.
Dopo il caricamento automatico del test, attendere che il vassoio si apra per posizionare la cartuccia del sensore e la piastra con 200 microlitri di calibrante. Impostare la direzione del codice a barre della cartuccia rivolta verso destra. Eseguire la calibrazione facendo clic su Sono pronto, operazione che richiede circa 20 minuti.
Dopo la calibrazione, fare clic su Apri vassoio, sostituire la piastra con la piastra seminata dalla cella e fare clic su Sono pronto per continuare il test. Dopo aver completato il test, i dati vengono salvati automaticamente. Esportare i risultati in un foglio di calcolo o in un altro file software di analisi.
Tracciare il grafico e analizzare i dati. La dinamica rappresentativa del tasso di consumo di ossigeno o OCR ha indicato cambiamenti nella respirazione mitocondriale nei neutrofili di topo e umani, nonché cellule HL60 indifferenziate e differenziate in risposta a oligomicina, FCCP e la miscela di rotenone e antimicina A.I valori OCR sono diminuiti in tutte le cellule dopo il trattamento con oligomicina a causa dell'inibizione del canale protonico dell'ATP sintasi. Il trattamento FCCP ha aumentato il flusso di elettroni e il consumo di ossigeno per ripristinare il valore OCR e ottenere la massima respirazione.
Una miscela di rotenone e antimicina A ha bloccato i complessi 1 e 3 della catena di trasporto degli elettroni, portando all'eliminazione della respirazione mitocondriale. Una diminuzione della respirazione mitocondriale è stata osservata nelle cellule HL60 dopo differenziazione diretta dai neutrofili. Le cellule HL60 differenziate sono risultate avere una respirazione mitocondriale basale significativamente più bassa, una respirazione legata alla perdita di protoni, una respirazione legata all'ATP e una respirazione non mitocondriale.
L'aumento della respirazione massima delle cellule HL60 differenziate non è stato sostanziale, mentre la capacità respiratoria di riserva è stata significativamente aumentata. Assicurarsi che le celle siano nella parte inferiore della piastra, poiché la cartuccia del sensore non dovrebbe presentare ostacoli a causa delle celle mobili durante la lettura del valore OCR. Questa tecnica aiuterebbe i ricercatori a studiare l'effetto dei farmaci o della disfunzione mitocondriale negli studi associati ai neutrofili.
