Этот протокол фокусируется на количественной оценке митохондриального дыхания нейтрофилов мыши и человека, а также нейтрофилоподобных клеток HL60 с использованием анализатора метаболического внеклеточного потока. Этот метод позволяет количественно оценить функцию митохондрий в нейтрофилах в норме и при заболевании. Это простой метод, который может дать представление о митохондриальной функции клеток в ответ на лекарства или любое заболевание.
Поскольку разные клетки имеют разную эффективность дыхания митохондрий, для получения высококачественных результатов необходимо точно оптимизировать плотность посева клеток и концентрацию реагентов. Чтобы начать анализ метаболического внеклеточного потока, возьмите картридж датчика, упакованный в специально разработанную 96-луночную пластину, и перенесите 200 микролитров калибровочной среды в каждую лунку нижележащей пластины. Осторожно поднимите картридж и пластину с калибром и поместите их в инкубатор, увлажненный до 37 градусов по Цельсию без углекислого газа, на ночь для увлажнения.
Затем, в зависимости от типа ячейки, покройте 96-луночную пластину специальным покрытием, чтобы обеспечить адгезию ячейки. После этого дважды вымойте тарелки 200 микролитрами стерильного PBS. Приготовьте тестовую среду в DMEM с одним миллимолярным пируватом, 10 миллимолярной глюкозой и двумя миллимолярными глутаминами.
Закупите нейтрофильные клетки мыши и человека, как описано в текстовой рукописи. Для нейтрофилов, полученных от мыши, отрегулируйте плотность клеток в 1,1 раза от 10 до шестой клетки на миллилитр, добавив анализную среду. Затем засейте 180 микролитров суспензии нейтрофилов мыши в каждую лунку в подготовленную 96-луночную пластину.
Точно так же отрегулируйте плотность нейтрофильных клеток человека в 2,2 раза от 10 до шестой клетки на миллилитр, используя тестовую среду. В день анализа подсчитайте нейтрофилоподобные клетки HL60 вручную с помощью гемоцитометра. Затем центрифугируют дифференцированные или недифференцированные клетки HL60 при 300G при комнатной температуре в течение пяти минут.
Промойте клетки DMEM один раз и повторно суспендируйте их в анализной среде для достижения плотности клеток от 1,39 до 10 до шестой клетки на миллилитр. Затем засевают 180 микролитров дифференцированных или недифференцированных клеток HL60 в предварительно подготовленную 96-луночную пластину, содержащую образцы нейтрофилов мыши и человека. Наконец, добавьте полную среду в угловые лунки пластины для клеточных культур, лишенные клеток, для коррекции фона во время посева.
Центрифугируйте пластину при 300 г при комнатной температуре в течение трех минут без перерыва, чтобы обеспечить надлежащее прилегание ячеек к нижней части пластины. Наконец, инкубируйте планшет в течение одного часа, чтобы предварительно уравновесить клетки с анализирующей средой. Откройте набор для митохондриального стресс-теста и подготовьте реагенты в соответствии с инструкциями производителя.
Затем загрузите картридж с реагентами, начиная с приготовленного олигомицина в порт А, FCCP в порт B и смеси ротенона/антимицина А в порт C для инъекций. Заполните неиспользуемые порты 20 микролитрами анализирующей среды. Уравновесьте систему анализа при 37 градусах Цельсия не менее чем за пять часов до анализа, открыв программное обеспечение Wave и щелкнув вкладку «Нагреватель вкл.».
После достижения температуры в левом нижнем углу программного обеспечения Wave отображается готовность. Откройте шаблон для набора для анализа митохондриального стресса в программном обеспечении. Выберите стратегии инъекций слева, затем нажмите «Добавить» и назовите условие инъекции нейтрофилами человека, нейтрофилами мыши или HL60.
Выберите порты от A до D, щелкнув по каждому, и нажмите «Добавить соединение» и введите олигомицин или FCCP или ротенон/антимицин A с соответствующими концентрациями. Выберите «Предварительная обработка» слева, затем нажмите «Добавить» и назовите их CD18 и Cell Tak отдельно. Выберите тип ячейки с левой стороны.
Затем нажмите «Добавить» и назовите их нейтрофилами человека, нейтрофилами мыши и HL60 или DHL60 с плотностью кормления, если применимо. Определите группы, нажав «Добавить группу». Затем нажмите на подчеркнутое определение.
Нажмите «Карта плит» в верхнем меню, чтобы увидеть все группы с определениями слева и карту плит справа. Перетащите указатель, чтобы добавить каждую лунку в группу, сохранив при этом четыре угловых колодца в качестве фона. Чтобы настроить протокол, выберите вкладку «Протокол» в верхнем меню и определите три цикла базовой смеси, олигомицина, FCCP, ротенона и антимицина А, установив время смешивания как три минуты, отдых как ноль минут и измерение как семь минут.
Перейдите на страницу "Выполнить анализ", введите сводные сведения о проекте для справки и нажмите кнопку "Начать выполнение". Укажите место для сохранения файлов, чтобы все результаты были сохранены после завершения анализа. Затем снова нажмите «Запустить запуск».
После автоматической загрузки анализа подождите, пока лоток откроется, чтобы поместить картридж датчика и пластину с калибром 200 микролитров. Установите направление штрих-кода картриджа вправо. Запустите калибровку, нажав кнопку «Я готов», которая займет примерно 20 минут.
После калибровки нажмите «Открыть лоток», замените пластину пластиной с засеянной ячейкой и нажмите «Я готов», чтобы продолжить анализ. После завершения анализа данные автоматически сохраняются. Экспортируйте результаты в электронную таблицу или другой файл программного обеспечения для анализа.
Постройте график и проанализируйте данные. Репрезентативная динамика скорости потребления кислорода или OCR указывала на изменения митохондриального дыхания у нейтрофилов мыши и человека, а также недифференцированных и дифференцированных клеток HL60 в ответ на олигомицин, FCCP и смесь ротенона и антимицина А. Значения OCR снизились во всех клетках после лечения олигомицином из-за ингибирования протонного канала АТФ-синтазы. Лечение FCCP увеличило поток электронов и потребление кислорода для восстановления значения OCR и достижения максимального дыхания.
Смесь ротенона и антимицина А блокировала комплексы 1 и 3 цепи переноса электронов, приводя к элиминации митохондриального дыхания. Снижение митохондриального дыхания наблюдалось в клетках HL60 после нейтрофил-направленной дифференцировки. Было обнаружено, что дифференцированные клетки HL60 имеют значительно более низкое базальное митохондриальное дыхание, дыхание, связанное с утечкой протона, дыхание, связанное с АТФ, и немитохондриальное дыхание.
Увеличение максимального дыхания дифференцированных клеток HL60 было незначительным, в то время как резервная дыхательная способность была достоверно увеличена. Убедитесь, что ячейки находятся в нижней части пластины, так как картридж датчика не должен иметь никаких препятствий из-за плавающих ячеек при считывании значения OCR. Этот метод поможет исследователям изучить влияние лекарств или митохондриальной дисфункции в исследованиях, связанных с нейтрофилами.
