Bu protokol, fare ve insan nötrofillerinin mitokondriyal solunumunun yanı sıra metabolik hücre dışı akı analizörü kullanılarak nötrofil benzeri HL60 hücrelerinin ölçülmesine odaklanmaktadır. Bu yöntem, normal ve hastalık koşulları altında nötrofillerdeki mitokondriyal fonksiyonu ölçmemizi sağlar. Bu, ilaçlara veya herhangi bir hastalık durumuna yanıt olarak hücrelerin mitokondriyal fonksiyonu hakkında fikir verebilen basit bir tekniktir.
Farklı hücreler farklı mitokondriyal solunum verimliliğine sahip olduklarından, yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için hücre tohumlama yoğunluğunun ve reaktif konsantrasyonunun optimizasyonu doğru bir şekilde yapılmalıdır. Metabolik hücre dışı akı testine başlamak için, özel olarak tasarlanmış 96 delikli bir plaka üzerinde paketlenmiş bir sensör kartuşu alın ve altta yatan plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre kalibrasyon ortamı aktarın. Kartuşu ve plakayı calibrant ile dikkatlice kaldırın ve hidrasyon için gece boyunca karbondioksit nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.
Daha sonra, hücre tipine bağlı olarak, hücre yapışmasını sağlamak için 96 delikli plakayı belirli bir kaplama ile kaplayın. Daha sonra, plakaları iki kez 200 mikrolitre steril PBS ile yıkayın. DMEM'deki tahlil ortamını bir milimolar piruvat, 10 milimolar glikoz ve iki milimolar glutamin ile hazırlayın.
Fare ve insan nötrofil hücrelerini metin el yazmasında açıklandığı gibi tedarik edin. Fareden temin edilen nötrofiller için, tahlil ortamı ekleyerek hücre yoğunluğunu mililitre başına altıncı hücrelere 1.1 kat 10 olarak ayarlayın. Daha sonra hazırlanan 96 delikli plakaya kuyu başına 180 mikrolitre fare nötrofil süspansiyonu tohumlayın.
Benzer şekilde, insan nötrofil hücre yoğunluğunu, tahlil ortamını kullanarak mililitre başına altıncı hücrelere 2.2 kat 10'a ayarlayın. Tahlil gününde, hemositometreyi kullanarak nötrofil benzeri HL60 hücrelerini manuel olarak sayın. Daha sonra farklılaşmış veya farklılaşmamış HL60 hücrelerini oda sıcaklığında 300G'de beş dakika boyunca santrifüj edin.
Hücreleri DMEM ile bir kez yıkayın ve mililitre başına 1.39 kat 10 ila altıncı hücreler arasında bir hücre yoğunluğu elde etmek için tahlil ortamında tekrar askıya alın. Daha sonra, fare ve insan nötrofil örneklerini içeren önceden hazırlanmış 96 delikli plakaya 180 mikrolitre farklılaştırılmış veya farklılaşmamış HL60 hücresi tohumlayın. Son olarak, tohumlama sırasında arka plan düzeltmesi için hücrelerden yoksun hücre kültürü plakasının köşe kuyucuklarına tam bir ortam ekleyin.
Plakanın altındaki hücrelerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında 300G'de üç dakika boyunca ara vermeden santrifüj edin. Son olarak, hücreleri tahlil ortamıyla önceden dengelemek için plakayı bir saat boyunca inkübe edin. Mitokondriyal stres test kitini açın ve reaktifleri üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
Daha sonra, kartuşu, hazırlanan oligomisin ile başlayarak A portuna, FCCP B portuna ve rotenon / antimisin A karışımını enjeksiyonlar için Port C'ye reaktiflerle yükleyin. Kullanılmayan portları 20 mikrolitre tahlil ortamı ile doldurun. Wave yazılımını açıp Isıtıcı Açık sekmesine tıklayarak tahlilden en az beş saat önce tahlil sistemini 37 santigrat derecede dengeleyin.
Sıcaklığa ulaştıktan sonra Wave yazılımının sol alt köşesi hazır görünüyor. Yazılımda mitokondriyal stres testi kiti için bir şablon açın. Sol taraftaki enjeksiyon stratejilerini seçin, ardından Ekle'ye tıklayın ve enjeksiyon durumunu insan nötrofilleri veya fare nötrofilleri veya HL60 olarak adlandırın.
Her birine tıklayarak A'dan D'ye bağlantı noktasını seçin ve Bileşik Ekle'ye tıklayın ve ilgili konsantrasyonlarla oligomisin veya FCCP veya rotenon / antimisin A'yı girin. Sol taraftaki Ön İşlem'i seçin, ardından Ekle'ye tıklayın ve bunları CD18 ve Hücre Tak'ı ayrı ayrı adlandırın. Sol taraftaki Hücre Türü'nü seçin.
Ardından Ekle'ye tıklayın ve bunları insan nötrofilleri, fare nötrofilleri ve HL60 veya DHL60 olarak uygun bir besleme yoğunluğuyla adlandırın. Grup Ekle'ye tıklayarak grupları tanımlayın. Ardından altı çizili tanıma tıklayın.
Sol tarafta tanımları olan tüm grupları ve sağda plaka haritasını gözlemlemek için üst menüdeki Plaka Haritası'na tıklayın. Dört köşe kuyucuğunu arka plan olarak korurken her bir kuyucuğu gruba eklemek için sürükleyip bırakın. Protokolü ayarlamak için, üst menüdeki Protokol sekmesini seçin ve karıştırma süresini üç dakika, dinlenme süresini sıfır dakika ve ölçüm süresini yedi dakika olarak ayarlayarak üç döngü taban çizgisi, oligomisin, FCCP, rotenon ve antimisin A karışımı tanımlayın.
Testi Çalıştır sayfasına gidin, başvuru için proje özet bilgilerini sağlayın ve Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Dosyaların kaydedileceği konumu verin, böylece tüm sonuçlar tahlilin tamamlanmasından sonra kaydedilir. Ardından tekrar Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın.
Tahlilin otomatik olarak yüklenmesinden sonra, sensör kartuşunu ve plakayı 200 mikrolitre calibrant ile yerleştirmek için tepsinin açılmasını bekleyin. Kartuş barkod yönünü sağa bakacak şekilde ayarlayın. Hazırım'ı tıklatarak kalibrasyonu çalıştırın, bu işlem yaklaşık 20 dakika sürer.
Kalibrasyondan sonra, Tepsiyi Aç'a tıklayın, plakayı hücre tohumlu plaka ile değiştirin ve tahlile devam etmek için Hazırım'a tıklayın. Testi tamamladıktan sonra, veriler otomatik olarak kaydedilir. Sonuçları bir elektronik tabloya veya başka bir analiz yazılımı dosyasına aktarın.
Grafiği çizin ve verileri analiz edin. Oksijen tüketim hızının veya OCR'nin temsili dinamikleri, fare ve insan nötrofillerinde mitokondriyal solunumdaki değişikliklerin yanı sıra, oligomisin, FCCP ve rotenon ve antimisin karışımına yanıt olarak farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücrelerinde değişiklikler olduğunu göstermiştir. FCCP tedavisi, OCR değerini geri kazanmak ve maksimum solunum elde etmek için elektron akışını ve oksijen tüketimini arttırdı.
Rotenon ve antimisin A karışımı, elektron taşıma zincirinin 1 ve 3 komplekslerini bloke ederek mitokondriyal solunumun ortadan kaldırılmasına yol açar. Nötrofil yönelimli farklılaşmadan sonra HL60 hücrelerinde azalmış mitokondriyal solunum gözlendi. Diferansiye HL60 hücrelerinin bazal mitokondriyal solunum, proton sızıntısına bağlı solunum, ATP'ye bağlı solunum ve mitokondriyal olmayan solunum ile anlamlı derecede düşük olduğu bulundu.
Diferansiye HL60 hücrelerinin maksimal solunumundaki artış önemli değildi, yedek solunum kapasitesi ise önemli ölçüde artmıştı. OCR değerini okurken sensör kartuşunun yüzen hücreler nedeniyle herhangi bir engeli olmaması gerektiğinden, hücrelerin plakanın altında olduğundan emin olun. Bu teknik, araştırmacıların nötrofil ile ilişkili çalışmalarda ilaçların veya mitokondriyal disfonksiyonun etkisini incelemelerine yardımcı olacaktır.
