このプロトコルは、代謝細胞外フラックスアナライザーを使用して、マウスおよびヒト好中球、および好中球様HL60細胞のミトコンドリア呼吸を定量化することに焦点を当てています。この方法により、正常および疾患条件下で好中球のミトコンドリア機能を定量化することができます。これは、薬物やあらゆる病状に反応して細胞のミトコンドリア機能に関する洞察を提供できる簡単な手法です。
細胞が異なればミトコンドリアの呼吸効率も異なるため、高品質の結果を得るには、細胞播種密度と試薬濃度の最適化を正確に行う必要があります。代謝細胞外フラックスアッセイを開始するには、特別に設計された96ウェルプレート上に充填されたセンサーカートリッジを取り、200マイクロリットルのキャリブレーション培地を下層のプレートの各ウェルに移します。カートリッジとプレートをキャリブラントで慎重に持ち上げ、二酸化炭素を含まない加湿された摂氏37度のインキュベーターに一晩入れて水分補給します。
次に、細胞の種類に基づいて、96ウェルプレートを特定のコーティングでコーティングし、細胞接着を確保します。その後、プレートを200マイクロリットルの滅菌PBSで2回洗浄します。1ミリモルのピルビン酸、10ミリモルのグルコース、および2ミリモルのグルタミンを含むDMEM中のアッセイ培地を調製します。
マウスとヒトの好中球細胞を、本文原稿に記載されているように調達します。マウスから調達した好中球については、アッセイ培地を添加して細胞密度を10〜6細胞/ミリリットルの1.1倍に調整する。次いで、1ウェルあたり180マイクロリットルのマウス好中球懸濁液を調製した96ウェルプレートに播種する。
同様に、アッセイ培地を用いてヒト好中球細胞密度を1ミリリットル当たり10〜6細胞の2.2倍に調整する。アッセイ当日に、血球計算盤を用いて好中球様HL60細胞を手動で計数する。次いで、分化または未分化HL60細胞を300Gで室温で5分間遠心分離する。
細胞をDMEMで1回洗浄し、アッセイ培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞の1.39倍の細胞密度を達成します。次に、180マイクロリットルの分化または未分化HL60細胞を、マウスおよびヒト好中球サンプルを含む予め調製された96ウェルプレートに播種する。最後に、播種中のバックグラウンド補正のために、細胞を含まない細胞培養プレートのコーナーウェルに完全な培地を追加します。
プレートを室温で300Gで3分間中断することなく遠心分離し、プレートの底部に細胞が適切に付着することを確認します。最後に、プレートを1時間インキュベートして、細胞をアッセイ培地で事前に平衡化します。ミトコンドリアストレステストキットを開き、製造元の指示に従って試薬を準備します。
次に、調製したオリゴマイシンをポートAに、FCCPをポートBに、ロテノン/抗マイシンA混合物をポートCに注入するために、試薬をカートリッジにロードします。未使用のポートに20マイクロリットルのアッセイ培地を充填します。アッセイの少なくとも5時間前に、Waveソフトウェアを開き、ヒーターオンタブをクリックして、アッセイシステムを摂氏37度で平衡化します。
温度に達すると、Waveソフトウェアの左下隅に準備完了が表示されます。ソフトウェアでミトコンドリアストレスアッセイキットのテンプレートを開きます。左側で注入方法を選択し、[追加]をクリックして、注入条件にヒト好中球またはマウス好中球またはHL60という名前を付けます。
ポートAからDをそれぞれクリックして選択し、[化合物の追加]をクリックして、オリゴマイシンまたはFCCPまたはロテノン/抗マイシンAをそれぞれの濃度で入力します。左側で[前処理]を選択し、[追加]をクリックして、CD18とCell Takに別々の名前を付けます。左側のセルタイプを選択します。
次に、[追加]をクリックして、ヒト好中球、マウス好中球、およびHL60またはDHL60に名前を付け、必要に応じて摂食密度を付けます。[グループの追加] をクリックしてグループを定義します。次に、下線付きの定義をクリックします。
トップメニューのプレートマップをクリックして、左側に定義があり、右側にプレートマップがあるすべてのグループを確認します。ドラッグアンドドロップして、4つのコーナーウェルを背景として維持しながら、各ウェルをグループに追加します。プロトコルを設定するには、トップメニューの[プロトコル]タブを選択し、混合時間を3分、休息時間を0分、測定を7分に設定して、ベースライン、オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、抗マイシンA混合物の3サイクルを定義します。
「アッセイの実行」ページに移動し、参照用のプロジェクト・サマリー情報を入力して、「実行の開始」をクリックします。アッセイの完了後にすべての結果が保存されるように、ファイルを保存する場所を指定します。次に、もう一度[実行の開始]をクリックします。
アッセイの自動ロード後、トレイが開くのを待って、センサーカートリッジとプレートに200マイクロリットルのキャリブラントを入れます。カートリッジのバーコードの方向を右に向けて設定します。[準備完了] をクリックしてキャリブレーションを実行します。これには約 20 分かかります。
キャリブレーション後、Open Trayをクリックし、プレートを細胞播種プレートと交換し、I'm Readyをクリックしてアッセイを続行します。アッセイが完了すると、データは自動的に保存されます。結果をスプレッドシートまたはその他の解析ソフトウェアファイルにエクスポートします。
グラフをプロットし、データを分析します。酸素消費速度またはOCRの代表的な動態は、オリゴマイシン、FCCP、およびロテノンと抗マイシンAの混合物に応答して、マウスおよびヒト好中球、ならびに未分化および分化HL60細胞におけるミトコンドリア呼吸の変化を示した。FCCP処理は、電子の流れと酸素消費量を増加させて、OCR値を回復し、最大の呼吸を達成しました。
ロテノンと抗マイシンAの混合物は、電子伝達鎖の複合体1および3をブロックし、ミトコンドリア呼吸の排除をもたらす。ミトコンドリア呼吸の低下は、好中球指向性分化後のHL60細胞で観察されました。分化したHL60細胞は、基底ミトコンドリア呼吸、プロトンリーク連鎖呼吸、ATP連鎖呼吸、および非ミトコンドリア呼吸が有意に低いことがわかりました。
分化したHL60細胞の最大呼吸の増加は有意ではなかったが、予備の呼吸能力は有意に増加した。OCR値の読み取り中にセンサーカートリッジにフローティングセルによる障害物があってはならないため、セルがプレートの下部にあることを確認してください。この技術は、研究者が好中球関連研究における薬物またはミトコンドリア機能障害の効果を研究するのに役立ちます。
