이 프로토콜은 대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 및 인간 호중구와 호중구 유사 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 정량화하는 데 중점을 둡니다. 이 방법을 사용하면 정상 및 질병 상태에서 호중구의 미토콘드리아 기능을 정량화할 수 있습니다. 이것은 약물이나 질병 상태에 대한 반응으로 세포의 미토콘드리아 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 간단한 기술입니다.
세포마다 미토콘드리아 호흡 효율이 다르기 때문에 고품질 결과를 얻으려면 세포 파종 밀도와 시약 농도를 정확하게 최적화해야 합니다. 대사 세포외 플럭스 분석을 시작하려면 특별히 설계된 96웰 플레이트 위에 포장된 센서 카트리지를 사용하여 200마이크로리터의 보정 배지를 기본 플레이트의 각 웰에 옮깁니다. 보정제로 카트리지와 플레이트를 조심스럽게 들어 올리고 수분 공급을 위해 밤새 이산화탄소가 아닌 가습 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다.
다음으로, 세포 유형에 따라 세포 접착을 보장하기 위해 특정 코팅으로 96웰 플레이트를 코팅합니다. 그 후, 플레이트를 200 마이크로리터의 멸균 PBS로 2회 세척한다. 1 밀리몰 피루브산, 10 밀리몰 글루코스 및 2 밀리몰 글루타민으로 DMEM에서 분석 배지를 준비합니다.
마우스 및 인간 호중구 세포를 텍스트 원고에 기술된 바와 같이 조달한다. 마우스로부터 조달된 호중구에 대해서는, 분석 배지를 첨가하여 세포 밀도를 밀리리터당 10 내지 6번째 세포로 1.1배로 조정하였다. 이어서, 마우스 호중구 현탁액을 웰 당 180 마이크로리터씩 준비된 96-웰 플레이트에 시딩한다.
유사하게, 분석 배지를 사용하여 인간 호중구 세포 밀도를 2.2배 10 내지 밀리리터당 6번째 세포로 조정한다. 분석 당일에, 혈구계를 사용하여 수동으로 호중구 유사 HL60 세포를 계수한다. 그 후 분화 또는 미분화된 HL60 세포를 실온에서 300G에서 5분 동안 원심분리한다.
세포를 DMEM으로 한번 세척하고, 이들을 분석 배지에서 재현탁시켜 밀리리터당 1.39 x 10 내지 6번째 세포의 세포 밀도를 달성한다. 다음으로, 분화 또는 미분화된 HL60 세포 180 마이크로리터를 마우스 및 인간 호중구 샘플을 함유하는 미리 준비된 96-웰 플레이트에 넣는다. 마지막으로, 파종하는 동안 배경 보정을 위해 세포가 없는 세포 배양 플레이트의 모서리 웰에 완전한 배지를 추가합니다.
플레이트를 실온에서 3분 동안 원심분리하여 플레이트 바닥에 있는 세포가 제대로 부착되도록 합니다. 마지막으로, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하여 세포를 분석 배지와 사전 평형화시킨다. 미토콘드리아 스트레스 테스트 키트를 열고 제조업체의 지침에 따라 시약을 준비합니다.
다음으로, 준비된 올리고마이신을 포트 A로, FCCP를 포트 B로, 로테논/안티마이신 A 혼합물을 포트 C로 주입하여 시약으로 카트리지를 로드합니다. 사용하지 않는 포트를 20마이크로리터의 분석 배지로 채웁니다. Wave 소프트웨어를 열고 Heater On 탭을 클릭하여 분석 최소 5시간 전에 섭씨 37도에서 분석 시스템을 평형화합니다.
온도에 도달하면 Wave 소프트웨어의 왼쪽 하단 모서리에 준비가 표시됩니다. 소프트웨어에서 미토콘드리아 스트레스 분석 키트에 대한 템플릿을 엽니다. 왼쪽에서 주입 전략을 선택한 다음 추가를 클릭하고 주입 조건의 이름을 인간 호중구 또는 마우스 호중구 또는 HL60으로 지정합니다.
각각을 클릭하여 포트 A에서 D를 선택하고 화합물 추가를 클릭하고 각 농도의 올리고마이신 또는 FCCP 또는 로테논/안티마이신 A를 입력합니다. 왼쪽에서 전처리를 선택한 다음 추가를 클릭하고 이름을 CD18 및 Cell Tak으로 별도로 지정합니다. 왼쪽에서 셀 유형을 선택합니다.
그런 다음 추가를 클릭하고 해당하는 경우 공급 밀도를 사용하여 이름을 인간 호중구, 마우스 호중구 및 HL60 또는 DHL60으로 지정합니다. Add Group(그룹 추가)을 클릭하여 그룹을 정의합니다. 그런 다음 밑줄이 그어진 정의를 클릭합니다.
상단 메뉴에서 플레이트 맵을 클릭하면 왼쪽에 정의가 있고 오른쪽에 플레이트 맵이 있는 모든 그룹을 관찰할 수 있습니다. 끌어서 놓으면 네 개의 모서리 웰을 배경으로 유지하면서 각 웰을 그룹에 추가할 수 있습니다. 프로토콜을 설정하려면 상단 메뉴에서 프로토콜 탭을 선택하고 혼합 시간을 3분, 휴식을 0분, 측정을 7분으로 설정하여 기준선, 올리고마이신, FCCP, 로테논 및 안티마이신 A 혼합물의 3주기를 정의합니다.
Run Assay 페이지로 이동하여 참조용 프로젝트 요약 정보를 제공하고 Start Run(실행 시작)을 클릭합니다. 분석 완료 후 모든 결과가 저장되도록 파일을 저장할 위치를 지정하십시오. 그런 다음 실행 시작을 다시 클릭합니다.
분석을 자동으로 로드한 후 트레이가 열릴 때까지 기다렸다가 센서 카트리지와 플레이트에 200마이크로리터의 교정제를 놓습니다. 카트리지 바코드 방향을 오른쪽으로 설정합니다. I'm Ready(준비됨)를 클릭하여 보정을 실행하며, 이 작업에는 약 20분이 소요됩니다.
보정 후 Open Tray(트레이 열기)를 클릭하고 플레이트를 세포 시드 플레이트로 교체한 다음 I'm Read(준비 완료)를 클릭하여 분석을 계속합니다. 분석 완료 후 데이터가 자동으로 저장됩니다. 결과를 스프레드시트 또는 기타 분석 소프트웨어 파일로 내보냅니다.
그래프를 플로팅하고 데이터를 분석합니다. 산소 소비율 또는 OCR의 대표적인 역학은 올리고마이신, FCCP 및 로테논과 안티마이신의 혼합물에 반응하여 미분화 및 분화된 HL60 세포뿐만 아니라 마우스 및 인간 호중구에서 미토콘드리아 호흡의 변화를 나타냅니다. FCCP 치료는 전자의 흐름과 산소 소비를 증가시켜 OCR 값을 복원하고 최대 호흡을 달성했습니다.
로테논과 안티마이신 A의 혼합물은 전자 수송 사슬의 복합체 1과 3을 차단하여 미토콘드리아 호흡을 제거합니다. 감소된 미토콘드리아 호흡은 호중구 지시 분화 후 HL60 세포에서 관찰되었습니다. 분화된 HL60 세포는 기저 미토콘드리아 호흡, 양성자 누출 연결 호흡, ATP 연결 호흡 및 비미토콘드리아 호흡이 유의하게 낮은 것으로 밝혀졌습니다.
분화된 HL60 세포의 최대 호흡 증가는 크지 않은 반면, 예비 호흡 용량은 유의하게 증가했습니다. OCR 값을 읽는 동안 센서 카트리지가 플로팅 셀로 인해 장애물이 없어야 하므로 셀이 플레이트 바닥에 있는지 확인하십시오. 이 기술은 연구자들이 호중구 관련 연구에서 약물 또는 미토콘드리아 기능 장애의 효과를 연구하는 데 도움이 될 것입니다.
