Este protocolo concentra-se na quantificação da respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e de camundongos, bem como de células HL60 semelhantes a neutrófilos usando o analisador de fluxo extracelular metabólico. Este método permite quantificar a função mitocondrial em neutrófilos em condições normais e de doença. Esta é uma técnica simples que pode fornecer informações sobre a função mitocondrial das células em resposta a drogas ou qualquer condição de doença.
Uma vez que diferentes células têm diferentes eficiências respiratórias mitocondriais, a otimização da densidade de semeadura celular e da concentração de reagentes deve ser realizada com precisão para obter resultados de alta qualidade. Para iniciar o ensaio de fluxo extracelular metabólico, pegue um cartucho de sensor embalado sobre uma placa de 96 poços especialmente projetada e transfira 200 microlitros de meio de calibração para cada poço da placa subjacente. Levante cuidadosamente o cartucho e a placa com calibrador e coloque-o em uma incubadora não umidificada de dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite para hidratação.
Em seguida, com base no tipo de célula, revestir a placa de 96 poços com um revestimento específico para garantir a adesão celular. Depois, lave as placas com 200 microlitros de PBS estéril duas vezes. Preparar o meio de ensaio em DMEM com um piruvato milimolar, glicose 10 milimolares e glutamina milimolar.
Procure as células de camundongo e de neutrófilos humanos conforme descrito no manuscrito do texto. Para os neutrófilos obtidos do rato, ajuste a densidade celular para 1,1 vezes 10 à sexta célula por mililitro adicionando meio de ensaio. Em seguida, semeie 180 microlitros da suspensão de neutrófilos de camundongo por poço na placa preparada de 96 poços.
Da mesma forma, ajustar a densidade de células de neutrófilos humanos para 2,2 vezes 10 para a sexta células por mililitro usando o meio de ensaio. No dia do ensaio, conte manualmente as células HL60 semelhantes a neutrófilos usando o hemocitômetro. Em seguida, centrifugar as células HL60 diferenciadas ou indiferenciadas a 300G à temperatura ambiente por cinco minutos.
Lave as células com DMEM uma vez e suspenda-as novamente no meio de ensaio para atingir uma densidade celular de 1,39 vezes 10 a sexta células por mililitro. Em seguida, semeie 180 microlitros de células HL60 diferenciadas ou indiferenciadas na placa pré-preparada de 96 poços contendo amostras de neutrófilos de camundongos e humanos. Finalmente, adicione meio completo aos poços de canto da placa de cultura de células desprovida de células para correção de fundo durante a semeadura.
Centrifugar a placa a 300G à temperatura ambiente durante três minutos sem pausa para garantir a aderência adequada das células no fundo da placa. Finalmente, incubar a placa por uma hora para pré-equilibrar as células com o meio de ensaio. Abra o kit de teste de estresse mitocondrial e prepare os reagentes de acordo com as instruções do fabricante.
Em seguida, carregue o cartucho com reagentes, começando com a oligomicina preparada na porta A, FCCP na porta B e mistura de rotenona/antimicina A na porta C para injeções. Preencha as portas não utilizadas com 20 microlitros de meio de ensaio. Equilibre o sistema de ensaio a 37 graus Celsius pelo menos cinco horas antes do ensaio abrindo o software Wave e clicando na guia Heater On.
Depois de atingir a temperatura, o canto inferior esquerdo do software Wave mostra-se pronto. Abra um modelo para o kit de ensaio de estresse mitocondrial no software. Selecione estratégias de injeção no lado esquerdo, clique em Adicionar e nomeie a condição de injeção como neutrófilos humanos ou neutrófilos de camundongo ou HL60.
Selecione a porta A a D clicando em cada uma delas, clique em Adicionar composto e digite oligomicina ou FCCP ou rotenona/antimicina A com as respectivas concentrações. Selecione Pré-tratamento no lado esquerdo, clique em Adicionar e nomeie-os CD18 e Cell Tak separadamente. Selecione o Tipo de célula no lado esquerdo.
Em seguida, clique em Adicionar e nomeie-os como neutrófilos humanos, neutrófilos de camundongo e HL60 ou DHL60 com uma densidade de alimentação, conforme aplicável. Defina os grupos clicando em Adicionar grupo. Em seguida, clique na definição sublinhada.
Clique em Mapa de Placas no menu superior para observar todos os grupos com definições no lado esquerdo e o mapa de placas à direita. Arraste e solte para adicionar cada poço ao grupo, mantendo os quatro poços de canto como plano de fundo. Para configurar o protocolo, selecione a guia Protocolo no menu superior e defina três ciclos de mistura de linha de base, oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina A, definindo o tempo para misturar como três minutos, descanso como zero minutos e medição como sete minutos.
Vá para a página Executar Ensaio, forneça as informações de resumo do projeto para referência e clique em Iniciar Execução. Forneça o local para salvar os arquivos para que todos os resultados sejam salvos após a conclusão do ensaio. Em seguida, clique em Iniciar execução novamente.
Após o carregamento automático do ensaio, aguarde a abertura da bandeja para colocar o cartucho sensor e a placa com 200 microlitros de calibrador. Defina a direção do código de barras do cartucho voltada para a direita. Execute a calibração clicando em Estou Pronto, o que leva aproximadamente 20 minutos.
Após a calibração, clique em Abrir Bandeja, substitua a placa pela placa semeada e clique em Estou Pronto para continuar o ensaio. Após a conclusão do ensaio, os dados são salvos automaticamente. Exporte os resultados para uma planilha ou outro arquivo de software de análise.
Plote o gráfico e analise os dados. A dinâmica representativa da taxa de consumo de oxigênio ou OCR indicou alterações na respiração mitocondrial em neutrófilos humanos e de camundongos, bem como células HL60 indiferenciadas e diferenciadas em resposta à oligomicina, FCCP e à mistura de rotenona e antimicina A. Os valores de OCR diminuíram em todas as células após o tratamento com oligomicina devido à inibição do canal de prótons da ATP sintase. O tratamento com FCCP aumentou o fluxo de elétrons e o consumo de oxigênio para restaurar o valor de OCR e alcançar a respiração máxima.
Uma mistura de rotenona e antimicina A bloqueou os complexos 1 e 3 da cadeia de transporte de elétrons, levando à eliminação da respiração mitocondrial. Diminuição da respiração mitocondrial foi observada em células HL60 após diferenciação dirigida por neutrófilos. Células HL60 diferenciadas apresentaram respiração mitocondrial basal significativamente menor, respiração ligada a vazamento de prótons, respiração ligada a ATP e respiração não mitocondrial.
O aumento da respiração máxima das células HL60 diferenciadas não foi substancial, enquanto a capacidade respiratória sobressalente aumentou significativamente. Certifique-se de que as células estejam na parte inferior da placa, pois o cartucho do sensor não deve ter obstáculos devido às células flutuantes durante a leitura do valor de OCR. Essa técnica ajudaria os pesquisadores a estudar o efeito de drogas ou disfunção mitocondrial em estudos associados a neutrófilos.
