Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Quantifizierung der mitochondrialen Atmung von Maus und menschlichen Neutrophilen sowie von neutrophilenähnlichen HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator. Diese Methode ermöglicht es uns, die mitochondriale Funktion in neutrophilen Granulozyten unter normalen und krankheitsbedingten Bedingungen zu quantifizieren. Dies ist eine einfache Technik, die Einblicke in die mitochondriale Funktion der Zellen als Reaktion auf Medikamente oder andere Krankheiten liefern kann.
Da verschiedene Zellen eine unterschiedliche mitochondriale Atmungseffizienz aufweisen, muss die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Reagenzienkonzentration genau durchgeführt werden, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen. Um mit dem metabolischen extrazellulären Flussassay zu beginnen, nehmen Sie eine Sensorkartusche, die auf einer speziell entwickelten 96-Well-Platte verpackt ist, und übertragen Sie 200 Mikroliter Kalibriermedium in jede Vertiefung der darunter liegenden Platte. Heben Sie die Kartusche und die Platte vorsichtig mit Calibrant an und legen Sie sie über Nacht zur Flüssigkeitszufuhr in einen mit Kohlendioxid befeuchteten Inkubator mit 37 Grad Celsius.
Als nächstes wird die 96-Well-Platte je nach Zelltyp mit einer speziellen Beschichtung beschichtet, um die Zellhaftung zu gewährleisten. Waschen Sie die Platten anschließend zweimal mit 200 Mikrolitern sterilem PBS. Bereiten Sie das Testmedium in DMEM mit einem Millimolarenpyruvat, 10 Millimolaren Glukose und zwei Millimolaren Glutamin vor.
Beschaffung der neutrophilen Zellen der Maus und des Menschen wie im Textmanuskript beschrieben. Für die aus der Maus gewonnenen Neutrophilen wird die Zelldichte durch Zugabe von Assaymedium auf 1,1 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter eingestellt. Säen Sie dann 180 Mikroliter der neutrophilen Maussuspension pro Well in die vorbereitete 96-Well-Platte.
In ähnlicher Weise wird die Zelldichte der humanen neutrophilen Granulozyten mit dem Assaymedium auf 2,2 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter eingestellt. Zählen Sie am Tag des Assays die neutrophilen HL60-Zellen manuell mit dem Hämozytometer. Anschließend werden die differenzierten oder undifferenzierten HL60-Zellen bei 300 G bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugiert.
Waschen Sie die Zellen einmal mit DMEM und suspendieren Sie sie erneut im Assay-Medium, um eine Zelldichte von 1,39 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen. Als nächstes werden 180 Mikroliter differenzierter oder undifferenzierter HL60-Zellen in die vorbereitete 96-Well-Platte mit den Neutrophilenproben der Maus und des Menschen gesät. Zum Schluss geben Sie das komplette Medium in die Eckvertiefungen der Zellkulturplatte, die keine Zellen enthalten, um den Hintergrund während der Aussaat zu korrigieren.
Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g bei Raumtemperatur drei Minuten lang ohne Pause, um sicherzustellen, dass die Zellen auf dem Boden der Platte richtig haften. Zum Schluss inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang, um die Zellen mit dem Assay-Medium vorzuäquilibrieren. Öffnen Sie das mitochondriale Stresstest-Kit und bereiten Sie die Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
Füllen Sie als Nächstes die Patrone mit Reagenzien, beginnend mit dem vorbereiteten Oligomycin in Port A, FCCP in Port B und Rotenon/Antimycin A-Gemisch in Port C für Injektionen. Füllen Sie die unbenutzten Anschlüsse mit 20 Mikrolitern Assay-Medium. Äquilibrieren Sie das Assay-System mindestens fünf Stunden vor dem Assay bei 37 Grad Celsius, indem Sie die Wave-Software öffnen und auf die Registerkarte Heizung ein klicken.
Nach Erreichen der Temperatur wird in der unteren linken Ecke der Wave-Software Ready angezeigt. Öffnen Sie eine Vorlage für das mitochondriale Stress-Assay-Kit in der Software. Wählen Sie auf der linken Seite Injektionsstrategien aus, klicken Sie dann auf Hinzufügen und benennen Sie die Injektionsbedingung als menschliche Neutrophile oder Maus-Neutrophile oder HL60.
Wählen Sie die Anschlüsse A bis D aus, indem Sie auf die einzelnen Anschlüsse klicken, klicken Sie auf Verbindung hinzufügen und geben Sie Oligomycin oder FCCP oder Rotenon/Antimycin A mit den entsprechenden Konzentrationen ein. Wählen Sie auf der linken Seite Vorbehandlung aus, klicken Sie dann auf Hinzufügen und benennen Sie sie separat CD18 und Cell Tak. Wählen Sie den Zellentyp auf der linken Seite aus.
Klicken Sie dann auf Hinzufügen, und nennen Sie sie menschliche Neutrophile, Maus-Neutrophile und HL60 oder DHL60 mit einer ggf. Fütterungsdichte. Definieren Sie die Gruppen, indem Sie auf Gruppe hinzufügen klicken. Klicken Sie dann auf die unterstrichene Definition.
Wechseln Sie zur Seite Run Assay, geben Sie die Projektzusammenfassungsinformationen als Referenz an und klicken Sie auf Run starten. Geben Sie den Speicherort für die Dateien an, damit alle Ergebnisse nach Abschluss des Assays gespeichert werden. Klicken Sie dann erneut auf Ausführen starten.
Warten Sie nach dem automatischen Laden des Assays, bis sich das Fach geöffnet hat, um die Sensorkartusche und die Platte mit 200 Mikrolitern Kalibrant zu platzieren. Stellen Sie die Patronen-Barcode-Richtung nach rechts ein. Führen Sie die Kalibrierung durch, indem Sie auf "Ich bin bereit" klicken, was ungefähr 20 Minuten dauert.
Klicken Sie nach der Kalibrierung auf Fach öffnen, ersetzen Sie die Platte durch die Zellenplatte und klicken Sie auf Ich bin bereit, um den Assay fortzusetzen. Nach Abschluss des Assays werden die Daten automatisch gespeichert. Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Tabellenkalkulation oder eine andere Analysesoftware.
Zeichnen Sie das Diagramm und analysieren Sie die Daten. Die repräsentative Dynamik der Sauerstoffverbrauchsrate bzw. OCR deutete auf Veränderungen der mitochondrialen Atmung in Maus und humanen Neutrophilen sowie in undifferenzierten und differenzierten HL60-Zellen als Reaktion auf Oligomycin, FCCP und die Mischung aus Rotenon und Antimycin A hin.Die OCR-Werte sanken in allen Zellen nach Oligomycin-Behandlung aufgrund der Hemmung des Protonenkanals der ATP-Synthase. Die FCCP-Behandlung erhöhte den Elektronenfluss und den Sauerstoffverbrauch, um den OCR-Wert wiederherzustellen und eine maximale Atmung zu erreichen.
Ein Gemisch aus Rotenon und Antimycin A blockierte die Komplexe 1 und 3 der Elektronentransportkette, was zur Eliminierung der mitochondrialen Atmung führte. Eine verminderte mitochondriale Atmung wurde in HL60-Zellen nach Neutrophilen-gerichteter Differenzierung beobachtet. Es wurde festgestellt, dass differenzierte HL60-Zellen eine signifikant geringere basale mitochondriale Atmung, protonenleckgekoppelte Atmung, ATP-gekoppelte Atmung und nicht-mitochondriale Atmung aufwiesen.
Die Zunahme der maximalen Atmung differenzierter HL60-Zellen war nicht signifikant, während die freie Atemkapazität signifikant erhöht war. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen am Boden der Platte befinden, da die Sensorkartusche beim Ablesen des OCR-Wertes keine Hindernisse durch die schwebenden Zellen aufweisen sollte. Diese Technik würde Forschern helfen, die Wirkung von Medikamenten oder mitochondrialer Dysfunktion in Studien mit neutrophilen Granulozyten zu untersuchen.
