Ce protocole se concentre sur la quantification de la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines, ainsi que des cellules HL60 de type neutrophile à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique. Cette méthode nous permet de quantifier la fonction mitochondriale des neutrophiles dans des conditions normales et pathologiques. Il s’agit d’une technique simple qui peut fournir des informations sur la fonction mitochondriale des cellules en réponse à des médicaments ou à toute maladie.
Étant donné que différentes cellules ont une efficacité respiratoire mitochondriale différente, l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et de la concentration de réactif doit être effectuée avec précision pour obtenir des résultats de haute qualité. Pour commencer le test de flux extracellulaire métabolique, prenez une cartouche de capteur emballée sur une plaque de 96 puits spécialement conçue et transférez 200 microlitres de milieu d’étalonnage dans chaque puits de la plaque sous-jacente. Soulevez soigneusement la cartouche et la plaque avec un calibrant et placez-la dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant la nuit pour l’hydratation.
Ensuite, en fonction du type de cellule, enduisez la plaque à 96 puits d’un revêtement spécifique pour assurer l’adhérence de la cellule. Ensuite, lavez les assiettes avec 200 microlitres de PBS stérile deux fois. Préparer le milieu de dosage dans le DMEM avec un pyruvate millimolaire, 10 millimolaires de glucose et deux millimolaires de glutamine.
Procurez-vous les cellules de neutrophiles de souris et humaines comme décrit dans le manuscrit du texte. Pour les neutrophiles obtenus de la souris, ajuster la densité cellulaire à 1,1 fois 10 à la sixième cellule par millilitre en ajoutant un milieu de dosage. Ensuite, ensemencez 180 microlitres de la suspension de neutrophiles de souris par puits dans la plaque préparée à 96 puits.
De même, ajuster la densité des cellules neutrophiles humaines à 2,2 fois 10 à la sixième cellule par millilitre en utilisant le milieu de dosage. Le jour de l’essai, compter manuellement les cellules HL60 de type neutrophile à l’aide de l’hémocytomètre. Ensuite, centrifugez les cellules HL60 différenciées ou indifférenciées à 300G à température ambiante pendant cinq minutes.
Lavez les cellules avec DMEM une fois et re-suspendez-les dans le milieu de dosage pour atteindre une densité cellulaire de 1,39 fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Ensuite, ensemencez 180 microlitres de cellules HL60 différenciées ou indifférenciées dans la plaque de 96 puits pré-préparée contenant les échantillons de neutrophiles de souris et d’humains. Enfin, ajoutez un milieu complet aux puits d’angle de la plaque de culture cellulaire dépourvue de cellules pour la correction du fond pendant l’ensemencement.
Centrifuger la plaque à 300G à température ambiante pendant trois minutes sans rupture pour assurer une bonne adhérence des cellules au fond de la plaque. Enfin, incuber la plaque pendant une heure pour prééquilibrer les cellules avec le milieu de dosage. Ouvrez le kit de test de stress mitochondrial et préparez les réactifs conformément aux instructions du fabricant.
Ensuite, chargez la cartouche avec des réactifs, en commençant par l’oligomycine préparée dans le port A, FCCP dans le port B et le mélange roténone/antimycine A dans le port C pour les injections. Remplissez les orifices inutilisés avec 20 microlitres de milieu de dosage. Équilibrez le système de dosage à 37 degrés Celsius au moins cinq heures avant le test en ouvrant le logiciel Wave et en cliquant sur l’onglet Heater On.
Après avoir atteint la température, le coin inférieur gauche du logiciel Wave est prêt. Ouvrez un modèle pour le kit de test de stress mitochondrial dans le logiciel. Sélectionnez les stratégies d’injection sur le côté gauche, puis cliquez sur Ajouter et nommez la condition d’injection en neutrophiles humains ou neutrophiles de souris ou HL60.
Sélectionnez le port A à D en cliquant sur chacun, puis cliquez sur Ajouter un composé et entrez oligomycine ou FCCP ou roténone/antimycine A avec les concentrations respectives. Sélectionnez Prétraitement sur le côté gauche, puis cliquez sur Ajouter et nommez-les CD18 et Cell Tak séparément. Sélectionnez le type de cellule sur le côté gauche.
Cliquez ensuite sur Ajouter et nommez-les neutrophiles humains, neutrophiles de souris et HL60 ou DHL60 avec une densité d’alimentation selon le cas. Définissez les groupes en cliquant sur Ajouter un groupe. Cliquez ensuite sur la définition soulignée.
Cliquez sur Carte des plaques dans le menu supérieur pour observer tous les groupes avec les définitions sur le côté gauche et la carte des plaques sur la droite. Faites glisser et déposez pour ajouter chaque puits au groupe tout en conservant les quatre puits d’angle comme arrière-plan. Pour configurer le protocole, sélectionnez l’onglet Protocole dans le menu supérieur et définissez trois cycles de mélange, oligomycine, FCCP, roténone et antimycine A, en définissant le temps de mélange sur trois minutes, le repos sur zéro minute et la mesure sur sept minutes.
Accédez à la page Exécuter le test, fournissez les informations récapitulatives du projet à titre de référence, puis cliquez sur Démarrer l’exécution. Indiquez l’emplacement d’enregistrement des fichiers afin que tous les résultats soient enregistrés une fois le test terminé. Cliquez ensuite à nouveau sur Démarrer l’exécution.
Après le chargement automatique du test, attendez que le plateau s’ouvre pour placer la cartouche et la plaque du capteur avec 200 microlitres d’étalonnage. Réglez la direction du code-barres de la cartouche vers la droite. Exécutez l’étalonnage en cliquant sur Je suis prêt, ce qui prend environ 20 minutes.
Après l’étalonnage, cliquez sur Ouvrir le bac, remplacez la plaque par la plaque ensemencée par la cellule, puis cliquez sur Je suis prêt pour continuer le test. Une fois le test terminé, les données sont automatiquement enregistrées. Exportez les résultats vers une feuille de calcul ou un autre fichier logiciel d’analyse.
Tracez le graphique et analysez les données. La dynamique représentative du taux de consommation d’oxygène ou OCR a indiqué des changements dans la respiration mitochondriale chez les neutrophiles de souris et humains, ainsi que dans les cellules HL60 indifférenciées et différenciées en réponse à l’oligomycine, au FCCP et au mélange de roténone et d’antimycine A.Les valeurs OCR ont diminué dans toutes les cellules après le traitement à l’oligomycine en raison de l’inhibition du canal protonique de l’ATP synthase. Le traitement FCCP a augmenté le flux d’électrons et la consommation d’oxygène pour restaurer la valeur OCR et obtenir une respiration maximale.
Un mélange de roténone et d’antimycine A a bloqué les complexes 1 et 3 de la chaîne de transport d’électrons, conduisant à l’élimination de la respiration mitochondriale. Une diminution de la respiration mitochondriale a été observée dans les cellules HL60 après différenciation dirigée par les neutrophiles. Les cellules HL60 différenciées se sont avérées avoir une respiration mitochondriale basale significativement inférieure, une respiration liée à une fuite de protons, une respiration liée à l’ATP et une respiration non mitochondriale.
L’augmentation de la respiration maximale des cellules HL60 différenciées n’était pas substantielle, tandis que la capacité respiratoire de réserve était significativement augmentée. Assurez-vous que les cellules sont au bas de la plaque, car la cartouche de capteur ne doit pas avoir d’obstacles dus aux cellules flottantes lors de la lecture de la valeur OCR. Cette technique aiderait les chercheurs à étudier l’effet des médicaments ou du dysfonctionnement mitochondrial dans les études associées aux neutrophiles.
