Este protocolo se centra en cuantificar la respiración mitocondrial de neutrófilos humanos y de ratón, así como células HL60 similares a neutrófilos utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico. Este método nos permite cuantificar la función mitocondrial en neutrófilos en condiciones normales y de enfermedad. Esta es una técnica sencilla que puede proporcionar información sobre la función mitocondrial de las células en respuesta a medicamentos o cualquier condición de enfermedad.
Dado que diferentes células tienen diferente eficiencia respiratoria mitocondrial, la optimización de la densidad de siembra celular y la concentración de reactivos debe realizarse con precisión para obtener resultados de alta calidad. Para comenzar el ensayo de flujo extracelular metabólico, tome un cartucho sensor empaquetado sobre una placa de 96 pocillos especialmente diseñada y transfiera 200 microlitros de medio de calibración a cada pocillo de la placa subyacente. Levante con cuidado el cartucho y la placa con calibrante, y colóquelo en una incubadora humidificada sin dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante la noche para hidratarse.
A continuación, según el tipo de célula, cubra la placa de 96 pocillos con un recubrimiento específico para garantizar la adhesión celular. Después, lave las placas con 200 microlitros de PBS estéril dos veces. Preparar el medio de ensayo en DMEM con un piruvato milimolar, 10 milimolares de glucosa y dos milimolares de glutamina.
Obtener las células de ratón y neutrófilos humanos como se describe en el texto manuscrito. Para los neutrófilos obtenidos del ratón, ajuste la densidad celular a 1,1 veces 10 a la sexta células por mililitro agregando medio de ensayo. Luego siembre 180 microlitros de la suspensión de neutrófilos de ratón por pocillo en la placa preparada de 96 pocillos.
Del mismo modo, ajuste la densidad de células de neutrófilos humanos a 2,2 veces 10 a la sexta células por mililitro utilizando el medio de ensayo. El día del ensayo, cuente las células HL60 similares a los neutrófilos manualmente con el hemocitómetro. Luego centrifugar las células HL60 diferenciadas o indiferenciadas a 300 G a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Lave las células con DMEM una vez y vuelva a suspenderlas en el medio de ensayo para lograr una densidad celular de 1,39 veces 10 a la sexta células por mililitro. A continuación, siembre 180 microlitros de células HL60 diferenciadas o indiferenciadas en la placa de 96 pocillos preparada previamente que contiene las muestras de neutrófilos humanos y de ratón. Finalmente, agregue un medio completo a los pocillos de esquina de la placa de cultivo celular desprovisto de células para la corrección de fondo durante la siembra.
Centrifugar la placa a 300 G a temperatura ambiente durante tres minutos sin descanso para garantizar la adherencia adecuada de las células en la parte inferior de la placa. Finalmente, incubar la placa durante una hora para preequilibrar las células con el medio de ensayo. Abra el kit de prueba de esfuerzo mitocondrial y prepare los reactivos según las instrucciones del fabricante.
A continuación, cargue el cartucho con reactivos, comenzando con la oligomicina preparada en el puerto A, FCCP en el puerto B y la mezcla de rotenona/antimicina A en el puerto C para preparaciones inyectables. Llene los puertos no utilizados con 20 microlitros de medio de ensayo. Equilibre el sistema de ensayo a 37 grados centígrados al menos cinco horas antes del ensayo abriendo el software Wave y haciendo clic en la pestaña Calentador activado.
Después de alcanzar la temperatura, la esquina inferior izquierda del software Wave se muestra lista. Abra una plantilla para el kit de ensayo de estrés mitocondrial en el software. Seleccione estrategias de inyección en el lado izquierdo, luego haga clic en Agregar y nombre la condición de inyección como neutrófilos humanos o neutrófilos de ratón o HL60.
Seleccione el puerto A a D haciendo clic en cada uno, y haga clic en Agregar compuesto e ingrese oligomicina o FCCP o rotenona/antimicina A con las concentraciones respectivas. Seleccione Pretratamiento en el lado izquierdo, luego haga clic en Agregar y asígneles el nombre CD18 y Cell Tak por separado. Seleccione el Tipo de celda en el lado izquierdo.
Luego haga clic en Agregar y asígneles el nombre Neutrófilos humanos, Neutrófilos de ratón y HL60 o DHL60 con una densidad de alimentación según corresponda. Defina los grupos haciendo clic en Agregar grupo. Luego haga clic en la definición subrayada.
Haga clic en Mapa de placas en el menú superior para observar todos los grupos con definiciones en el lado izquierdo y el mapa de placas a la derecha. Arrastre y suelte para agregar cada pozo al grupo mientras mantiene los cuatro pozos de esquina como fondo. Para configurar el protocolo, seleccione la pestaña Protocolo en el menú superior y defina tres ciclos de mezcla de línea de base, oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A, estableciendo el tiempo para mezclar como tres minutos, el resto como cero minutos y la medición como siete minutos.
Vaya a la página Ejecutar ensayo, proporcione la información de resumen del proyecto como referencia y haga clic en Iniciar ejecución. Proporcione la ubicación para guardar los archivos para que todos los resultados se guarden después de completar el ensayo. Luego haga clic en Iniciar ejecución nuevamente.
Después de la carga automática del ensayo, espere a que se abra la bandeja para colocar el cartucho sensor y la placa con 200 microlitros de calibrante. Coloque la dirección del código de barras del cartucho mirando hacia la derecha. Ejecute la calibración haciendo clic en Estoy listo, lo que tarda aproximadamente 20 minutos.
Después de la calibración, haga clic en Abrir bandeja, reemplace la placa con la placa sembrada de celdas y haga clic en Estoy listo para continuar el ensayo. Después de completar el ensayo, los datos se guardan automáticamente. Exporte los resultados a una hoja de cálculo u otro archivo de software de análisis.
Trazar el gráfico y analizar los datos. La dinámica representativa de la tasa de consumo de oxígeno u OCR indicó cambios en la respiración mitocondrial en neutrófilos humanos y de ratón, así como células HL60 indiferenciadas y diferenciadas en respuesta a oligomicina, FCCP y la mezcla de rotenona y antimicina A. Los valores de OCR disminuyeron en todas las células después del tratamiento con oligomicina debido a la inhibición del canal de protones de la ATP sintasa. El tratamiento FCCP aumentó el flujo de electrones y el consumo de oxígeno para restaurar el valor de OCR y lograr la respiración máxima.
Una mezcla de rotenona y antimicina A bloqueó los complejos 1 y 3 de la cadena de transporte de electrones, lo que llevó a la eliminación de la respiración mitocondrial. Se observó una disminución de la respiración mitocondrial en las células HL60 después de la diferenciación dirigida a neutrófilos. Se encontró que las células HL60 diferenciadas tienen una respiración mitocondrial basal significativamente más baja, respiración vinculada a fugas de protones, respiración vinculada a ATP y respiración no mitocondrial.
El aumento en la respiración máxima de las células HL60 diferenciadas no fue sustancial, mientras que la capacidad respiratoria de reserva aumentó significativamente. Asegúrese de que las celdas estén en la parte inferior de la placa, ya que el cartucho del sensor no debe tener ningún obstáculo debido a las celdas flotantes mientras lee el valor de OCR. Esta técnica ayudaría a los investigadores a estudiar el efecto de los fármacos o la disfunción mitocondrial en estudios asociados a neutrófilos.
