Каллусная культура для растений представляет собой решение для точной, эффективной и быстрой оценки метаболической деградации ксенобиотиков в растениях. Каллусная культура растений может исключить микробиом или грибковое вмешательство и фотохимическую деградацию, упростить матричный эффект интактных растений, стандартизировать условия выращивания, сократить продолжительность обработки и требовать меньше экспериментальных усилий. Предложенный здесь метод может дать представление о поведении поглощения и метаболических механизмах различных органических загрязнителей сельскохозяйственных культур и может быть полезен для оценки экологических рисков.
Для начала автоклавируйте все оборудование и выполняйте все операции на ультрачистом рабочем столе, стерилизованном ультрафиолетовым излучением. Стерилизуйте яровизированную поверхность семян 75%-ным этиловым спиртом в течение 20 минут. Трижды промойте их стерильной деионизированной водой и снова простерилизуйте 20%-ной перекисью водорода в течение 20 минут.
Промыв семена стерилизованной деионизированной водой шесть раз, асептически проращивают их посевом на автоклавную, безгормональную среду Мурасиге и Скуга рН 5,8, содержащую 1%-ный агаровый гель, и инкубируют при температуре 26 градусов Цельсия с 16-часовым фотопериодом в течение 15 дней. После 15 дней инкубации семян разрежьте гипокотиль и семядоли саженца на небольшие кусочки по 0,5 сантиметра, чтобы получить экспланты. Трансформируют экспланты в чашку Петри, содержащую от 15 до 20 миллилитров автоклавной среды Murashige и Skoog с добавлением оксимона и фикоцианина, и инкубируют в темноте при температуре 26 градусов Цельсия в течение трех-четырех недель, чтобы вызвать каллус.
С помощью стерильного скальпеля и щипцов отделите костную мозоль диаметром примерно в один сантиметр, образовавшуюся от первоначальных эксплантов. Для лечения растворяют 2, 4-дибромфенол в 10 миллилитрах асептической жидкости Мурасиге и среды Скуг. Затем в приготовленный раствор 2, 4-дибромфенола добавьте три грамма отделенной морковной каллуса.
После приготовления среды в холостом контроле, как описано в рукописи, инкубируют все колбы в темноте. Для подготовки образца тщательно отделяют каллус от 2,3-дибромфеноловых колб и контролируют фильтрацией фильтрами из стекловолокна 0,45 мкм. Перед сбором трижды промойте мозоль сверхчистой водой.
Высушите всю собранную мозоль и гомогенизируйте 0,2 грамма высушенной каллуса с помощью высокопроизводительного измельчителя тканей при 70 герц в течение трех минут. С помощью стеклянного микрошприца добавьте 50 микролитров суррогатного дейтерированного 4-n-нанофенола в гомогенизированную мозоль и вихрь в течение одной минуты. Добавьте пять миллилитров раствора, содержащего равное соотношение метанола и воды, в шиповидную мозоль и обработайте ее ультразвуком в течение 30 минут, чтобы извлечь 2,4-дибромфенол и метаболиты.
После экстракции центрифугируют суспензию при 8 000 G при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут и собирают надосадочную жидкость путем пипетирования. Пропустите экстракт через гидрофильную липофильную сбалансированную твердофазную экстракцию или картридж HLB-SPE со скоростью потока один миллилитр в минуту. Разбавьте аналиты, пропустив шесть миллилитров метанола через картридж HLB-SPE.
Затем концентрируют полученный элюент до одного миллилитра под щадящей струей газообразного азота для инструментального анализа. Для анализа откройте дверцу колонного нагревателя. Затем установите колонку для жидкостной хроматографии сверхвысокой производительности, соединив входное отверстие колонки с клапаном впрыска, а выходное отверстие — с входным отверстием масс-спектрометра.
Вставьте концы трубок с растворителем A и B в соответствующие флаконы с растворителем. Поместите флаконы с образцами по серийному номеру в соответствующие места лотков для образцов и снова вставьте лотки для образцов в камеру для образцов. В окне программного обеспечения нажмите «Инструмент», затем «Метод входа», чтобы отредактировать условия для жидкостной хроматограммы.
Выберите MS Method (Метод MS) и настройте параметры масс-спектрального анализа. Нажмите «Файл», а затем «Создать», чтобы создать базу данных и присвоить ей имя. Загрузите пример программы, созданный выше, выбрав MS File, а затем Inlet File и Inject Volume.
Сохраните базу данных в папке образца проекта, нажав кнопку Файл и Сохранить. Затем выберите «Выполнить» и «Запустить» в главном окне программного обеспечения и нажмите «Получить образцы данных», а затем кнопку «ОК» в списке «Запустить выборку» для сбора данных. Чтобы обработать данные, выберите целевую строку данных и нажмите на окно хроматограммы, чтобы просмотреть хроматограмму МС-скана.
В окне хроматограммы нажмите «Дисплей», а затем «ТИЦ». После нажатия на сканирующую волну DS добавьте trace и OK для получения дочернего сканирования масс-спектров. Хроматограмма 2,4-дибромфенола, обработанного экстрактом каллуса моркови, показала наличие восьми различных метаболитов по сравнению с контрольными образцами.
Кроме того, отсутствие пика родительского 2,4-дибромфенола на хроматограмме свидетельствует о быстром метаболизме 2,4-дибромфенола в каллусе моркови в экспериментальных условиях. Кроме того, 2,4-дибромфенол, инкубированный в морковной каллусе, приводил к образованию метаболитов путем прямой конъюгации с глюкозой и аминокислотами. Все оборудование, а также среда Murashige и Skoog должны быть автоклавированы, чтобы дифференциация и поддержание каллуса растений выполнялись в асептических условиях.
Омиксные подходы, следующие этой процедуре, позволяют создать четкую фитотоксическую механистическую картину загрязнителей окружающей среды.
