Questo protocollo descrive un processo semplificato e conforme al PNL di trasduzione di cellule T primarie umane con il gene di interesse. Questa particolare tecnica è stata progettata per essere conveniente e conforme al PNL senza l'uso di costose piattaforme di produzione a sistema chiuso attualmente disponibili in molti centri accademici. Questo metodo potrebbe potenzialmente essere applicato alla generazione di terapie cellulari geneticamente modificate, tra cui, ma non solo, le cellule CAR-T, che hanno rappresentato un cambiamento di paradigma per affrontare le neoplasie ematologiche.
Per isolare la PBMC dalle cellule raccolte dopo la leucoaferesi del sangue del donatore, eseguire una centrifugazione a gradiente di densità a base di polisaccaridi del campione, mantenendo un rapporto reagente/campione di 1:2, centrifugando la miscela a 800 G per 30 minuti a temperatura ambiente con i freni disattivati. Quindi, utilizzando una micropipetta, raccogliere le PBMC in una provetta pulita da 50 millilitri. Lavare le celle due volte con PBS mediante centrifugazione.
Prima di risospendere le cellule lavate in terreno ematopoietico completo. Attivare circa 20 milioni di cellule ottenute aggiungendo 10 microlitri di reagente di stimolazione delle cellule T per ogni 2 milioni di cellule. Successivamente, dopo aver aggiunto l'interleuchina-2 umana ricombinante a 20 unità per millilitro, mescolare delicatamente la soluzione e trasferirla in una piastra a sei pozzetti.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 72 ore prima di eseguire la trasduzione virale. Il terzo giorno, trasferire la coltura cellulare in una provetta conica da 50 millilitri e mescolarla accuratamente. Centrifugare la provetta a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il reagente di attivazione.
Scartare completamente il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno completo prima di contare le cellule. Regolare il volume della sospensione cellulare utilizzando il terreno completo per ottenere una concentrazione che consenta di placcare 0,5 milioni di cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere interleuchina-7 umana ricombinante e interleuchina-15 umana ricombinante alle cellule a concentrazioni appropriate.
In una provetta separata, aggiungere la quantità desiderata di vectofusin-1 al terreno Opti-MEM, considerando il volume virale finale da utilizzare. Combina questa miscela con il virus concentrato in un rapporto di uno a uno, garantendo una miscelazione accurata. Successivamente, aggiungere la miscela risultante contenente il virus alle cellule.
Regolare il volume totale di ciascun pozzetto a 400 microlitri utilizzando un mezzo completo, se necessario. Dopo aver coperto la piastra con un coperchio, sigillarla con una pellicola di paraffina prima di centrifugarla a 1000 G per due ore a 32 gradi Celsius. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Il giorno successivo, raccogli e tira le cellule da ogni pozzetto in una provetta da 50 millilitri. Quindi, centrifugare le celle a 400 G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver rimosso con cura il surnatante, risospendere completamente il pellet in un millilitro di terreno completo prima di contare le cellule.
Quindi regolare la concentrazione cellulare con il terreno per ottenere 1 milione di cellule per millilitro e aggiungere l'interleuchina-7 ricombinante umana e l'interleuchina-15 ricombinante umana rispettivamente a 155 e 290 unità per millilitro prima di coltivare le cellule. Una volta raggiunto il numero di cellule desiderato, raccogliere e trasferire le cellule in provette da 50 millilitri e centrifugarle. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno per contare le cellule.
Dopo aver centrifugato nuovamente, scartare completamente il surnatante e risospendere il pellet in una soluzione di crioconservazione composta dal 50% di HSA e dal 40% di HBSS, a una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro per fiala criogenica. Trasferire 0,9 millilitri di sospensione cellulare ciascuno al numero richiesto di fiale criogeniche e aggiungere il 10% di dimetilsolfossido a ciascuna fiala criogenica. Posizionare le fiale criogeniche sul ghiaccio e spostarle rapidamente in un congelatore a velocità controllata per la crioconservazione.
Quindi trasferire i campioni crioconservati in un serbatoio di azoto liquido monitorato per la conservazione a lungo termine. Per valutare l'efficienza della trasduzione, aggiungere 500 microlitri di tampone FACS al campione in una provetta FACS o in una provetta FACS attivata da fluorescenza. Dopo aver centrifugato il campione a 400 G e a temperatura ambiente per cinque minuti, scartare completamente il surnatante utilizzando una pipetta.
Risospendere il pellet in una soluzione da una a cinque diluite di CD3 in tampone FACS. Vorticare il campione e incubare per 30 minuti su ghiaccio al buio prima di centrifugare come dimostrato in precedenza. Successivamente, dopo aver scartato completamente il surnatante, risospendere il pellet in una soluzione diluita da uno a 20 di 7-AAD nel tampone FACS.
Agitare questa miscela prima di incubarla per 10 minuti su ghiaccio in un ambiente buio. Infine, aggiungere 200 microlitri di tampone FACS e procedere all'analisi del campione utilizzando un citometro a flusso. L'analisi della vitalità delle cellule trasdotte ha rivelato che il giorno 14, oltre il 95% delle cellule era CD3 positivo e vivo dopo aver escluso le cellule positive 7-AAD, indicando un'attivazione e un'espansione delle cellule T di successo.
L'efficienza di trasduzione all'interno della popolazione CD3 positiva è stata misurata al 58,7% rispetto alle cellule non trasdotte, che hanno mostrato un'efficienza di trasduzione dello 0,51% Quando le cellule trasdotte sono state espanse dal quarto giorno al giorno 14, con sub-coltura ogni due giorni, le cellule hanno subito un'espansione di 25 volte. Il prodotto è stato sottoposto a vari test di controllo qualità e ha soddisfatto tutti i criteri stabiliti, indicando la sua idoneità per un ulteriore utilizzo. L'intera procedura deve essere eseguita con tecniche rigorosamente asettiche.
E il passaggio più complicato è il processo di trasduzione, in cui è necessario tenere conto di tutti i reagenti da aggiungere per mantenere un volume totale specifico.
