Dieses Protokoll beschreibt einen vereinfachten und GNP-konformen Prozess der Transduktion menschlicher primärer T-Zellen mit einem Gen von Interesse. Diese spezielle Technik wurde so konzipiert, dass sie kostengünstig und GNP-konform ist, ohne dass teure Fertigungsplattformen mit geschlossenen Systemen verwendet werden müssen, die derzeit in vielen akademischen Zentren verfügbar sind. Diese Methode könnte möglicherweise auf die Erzeugung genmodifizierter Zelltherapien angewendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CAR-T-Zellen, die einen Paradigmenwechsel zur Bekämpfung hämatologischer Malignome darstellen.
Um PBMC aus den Zellen zu isolieren, die nach der Leukapherese von Spenderblut entnommen wurden, führen Sie eine Dichtegradientenzentrifugation der Probe auf Polysaccharidbasis durch, wobei ein Reagenzien-Proben-Verhältnis von 1:2 beibehalten wird, indem Sie das Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei ausgeschalteten Bremsen zentrifugieren. Sammeln Sie dann mit einer Mikropipette die PBMCs in einem sauberen 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS durch Zentrifugation.
Vor der Resuspendierung der gewaschenen Zellen in vollständigen hämatopoetischen Medien. Aktivieren Sie etwa 20 Millionen der erhaltenen Zellen, indem Sie 10 Mikroliter T-Zell-Stimulationsreagenz pro 2 Millionen Zellen hinzufügen. Nachdem Sie rekombinantes humanes Interleukin-2 in 20 Einheiten pro Milliliter hinzugefügt haben, mischen Sie die Lösung vorsichtig und geben Sie sie in eine Sechs-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie die Virustransduktion durchführen. Am dritten Tag geben Sie die Zellkultur in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und mischen es gründlich. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um das Aktivierungsreagenz zu entfernen.
Entsorgen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter vollständigem Medium, bevor Sie die Zellen zählen. Passen Sie das Zellsuspensionsvolumen mit vollständigem Medium an, um eine Konzentration zu erreichen, die die Beschichtung von 0,5 Millionen Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte ermöglicht. Fügen Sie den Zellen rekombinantes humanes Interleukin-7 und rekombinantes humanes Interleukin-15 in geeigneten Konzentrationen hinzu.
Geben Sie in einem separaten Röhrchen die gewünschte Menge Vectofusin-1 in Opti-MEM-Medium unter Berücksichtigung des endgültigen zu verwendenden Virusvolumens. Kombinieren Sie diese Mischung mit dem konzentrierten Virus im Verhältnis eins zu eins, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Als nächstes fügen Sie die resultierende Mischung, die das Virus enthält, zu den Zellen hinzu.
Stellen Sie das Gesamtvolumen jeder Vertiefung bei Bedarf auf 400 Mikroliter mit vollständigem Medium ein. Nachdem Sie die Platte mit einem Deckel abgedeckt haben, verschließen Sie sie mit einer Paraffinfolie, bevor Sie sie zwei Stunden lang bei 1000 g bei 32 Grad Celsius zentrifugieren. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Am nächsten Tag sammeln Sie die Zellen aus jeder Vertiefung und ziehen sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 g und Raumtemperatur. Nachdem Sie den Überstand vorsichtig entfernt haben, resuspendieren Sie das Pellet vollständig in einem Milliliter vollständigem Medium, bevor Sie die Zellen zählen.
Passen Sie dann die Zellkonzentration mit dem Medium an, um 1 Million Zellen pro Milliliter zu erreichen, und fügen Sie humanes rekombinantes Interleukin-7 und humanes rekombinantes Interleukin-15 in 155 bzw. 290 Einheiten pro Milliliter hinzu, bevor Sie die Zellen kultivieren. Sobald die gewünschte Zellzahl erreicht ist, werden die Zellen geerntet, in 50-Milliliter-Röhrchen überführt und zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Medien, um die Zellen zu zählen.
Nach dem erneuten Zentrifugieren wird der Überstand vollständig verworfen und das Pellet in einer Kryokonservierungslösung aus 50 % HSA und 40 % HBSS in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter pro Kryofläschchen resuspendiert. Übertragen Sie jeweils 0,9 Milliliter Zellsuspension in die erforderliche Anzahl von Kryofläschchen und fügen Sie 10% Dimethylsulfoxid in jedes Kryofläschchen hinzu. Stellen Sie die Kryofläschchen auf Eis und schieben Sie sie zur Kryokonservierung schnell in einen Gefrierschrank mit kontrollierter Geschwindigkeit.
Füllen Sie dann die kryokonservierten Proben zur Langzeitlagerung in einen überwachten Flüssigstickstofftank. Um die Transduktionseffizienz zu bewerten, geben Sie der Probe 500 Mikroliter FACS-Puffer in ein fluoreszenzaktiviertes Zellsortier- oder FACS-Röhrchen. Nachdem Sie die Probe fünf Minuten lang bei 400 g und Raumtemperatur zentrifugiert haben, entsorgen Sie den Überstand vollständig mit einer Pipette.
Resuspendieren Sie das Pellet in einer ein- bis fünffach verdünnten Lösung von CD3 in FACS-Puffer. Die Probe wird vortexen und 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis inkubiert, bevor sie wie zuvor gezeigt zentrifugiert wird. Nachdem Sie den Überstand vollständig verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in einer ein bis 20 verdünnten Lösung von 7-AAD in FACS-Puffer.
Wirbeln Sie diese Mischung ein, bevor Sie sie 10 Minuten lang auf Eis in einer dunklen Umgebung inkubieren. Fügen Sie schließlich 200 Mikroliter FACS-Puffer hinzu Und fahren Sie mit der Analyse der Probe mit einem Durchflusszytometer fort. Die Viabilitätsanalyse der transduzierten Zellen ergab, dass an Tag 14 mehr als 95% der Zellen CD3-positiv und lebendig waren, nachdem 7-AAD-positive Zellen ausgeschlossen wurden, was auf eine erfolgreiche T-Zell-Aktivierung und -Expansion hinweist.
Die Transduktionseffizienz innerhalb der CD3-positiven Population betrug 58,7 % im Vergleich zu den nicht transduzierten Zellen, die eine Transduktionseffizienz von 0,51 % aufwiesen. Das Produkt wurde verschiedenen Qualitätskontrolltests unterzogen und erfüllte alle festgelegten Kriterien, was auf seine Eignung für die weitere Verwendung hinweist. Das gesamte Verfahren sollte mit streng aseptischen Techniken durchgeführt werden.
Und der schwierigste Schritt ist der Transduktionsprozess, bei dem alle Reagenzien berücksichtigt werden müssen, die hinzugefügt werden müssen, um ein bestimmtes Gesamtvolumen aufrechtzuerhalten.
