Этот протокол описывает упрощенный и совместимый с GNP процесс трансдуцации первичных Т-клеток человека с интересующим геном. Этот конкретный метод был разработан таким образом, чтобы быть экономически эффективным и совместимым с GNP без использования дорогостоящих платформ для производства закрытых систем, доступных в настоящее время во многих академических центрах. Этот метод потенциально может быть применен для создания генно-модифицированной клеточной терапии, включая, помимо прочего, CAR-Т-клетки, которые стали сдвигом парадигмы в борьбе с гематологическими злокачественными новообразованиями.
Чтобы выделить ПБМК из клеток, собранных после лейкафереза донорской крови, проводят градиентное центрифугирование образца с градиентом плотности на основе полисахаридов, поддерживая соотношение реагента к образцу 1:2, путем центрифугирования смеси при 800 G в течение 30 минут при комнатной температуре при выключенных тормозах. Затем с помощью микропипетки соберите PBMC в чистую пробирку объемом 50 миллилитров. Промойте клетки дважды PBS центрифугированием.
Перед ресуспендированием промытых клеток в полных кроветворных средах. Активируйте около 20 миллионов полученных клеток, добавив 10 микролитров реагента стимуляции Т-клеток на каждые 2 миллиона клеток. Далее, после добавления рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 в количестве 20 единиц на миллилитр, раствор аккуратно перемешать и переложить в шестилуночную тарелку.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 72 часов перед выполнением вирусной трансдукции. На третий день переложите клеточную культуру в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и тщательно перемешайте. Центрифугируйте пробирку при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить активационный реагент.
Полностью выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре полной среды перед подсчетом клеток. Отрегулируйте объем суспензии ячеек с помощью полной среды для достижения концентрации, позволяющей наносить 0,5 миллиона клеток на лунку в 24-луночном планшете. Добавьте в клетки рекомбинантный человеческий интерлейкин-7 и рекомбинантный человеческий интерлейкин-15 в соответствующих концентрациях.
В отдельной пробирке добавляют желаемое количество вектофузина-1 в среду Opti-MEM с учетом конечного вирусного объема, который будет использоваться. Смешайте эту смесь с концентрированным вирусом в соотношении один к одному, обеспечив тщательное перемешивание. Далее добавьте к клеткам полученную смесь, содержащую вирус.
При необходимости отрегулируйте общий объем каждой лунки до 400 микролитров, используя полную среду. Накрыв тарелку крышкой, запечатайте ее парафиновой пленкой перед центрифугированием при 1000 г в течение двух часов при температуре 32 градуса Цельсия. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
На следующий день соберите и вытащите клетки из каждой лунки в пробирку объемом 50 миллилитров. Затем центрифугируйте клетки при температуре 400G и комнатной температуре в течение пяти минут. Осторожно удалив надосадочную жидкость, полностью ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре полной среды перед подсчетом клеток.
Затем отрегулируйте концентрацию клеток с помощью среды до достижения 1 миллиона клеток на миллилитр и добавьте человеческий рекомбинантный интерлейкин-7 и человеческий рекомбинантный интерлейкин-15 в концентрациях 155 и 290 единиц на миллилитр соответственно перед культивированием клеток. Как только желаемое количество клеток будет достигнуто, соберите и перенесите клетки в пробирки объемом 50 миллилитров и центрифугируйте их. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах среды для подсчета клеток.
После повторного центрифугирования полностью выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в криоконсервационном растворе, состоящем из 50% HSA и 40% HBSS, в концентрации 10 миллионов клеток на миллилитр на криофлакон. Перелейте по 0,9 миллилитра клеточной суспензии в необходимое количество криофлаконов и добавьте 10% диметилсульфоксид в каждый криофлакон. Поместите криофлаконы на лед и быстро переместите их в морозильную камеру с контролируемой скоростью для криоконсервации.
Затем переложите криоконсервированные образцы в контролируемый резервуар с жидким азотом для длительного хранения. Чтобы оценить эффективность трансдукции, добавьте 500 микролитров буфера FACS к образцу в флуоресцентно-активированной сортировке клеток или пробирке FACS. После центрифугирования образца при температуре 400G и комнатной температуре в течение пяти минут полностью выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
Ресуспендируйте гранулу в растворе CD3 в буфере FACS от одного до пяти разбавленных. Встряхните образец и инкубируйте в течение 30 минут на льду в темноте перед центрифугированием, как показано ранее. Затем, после полного удаления надосадочной жидкости, повторно суспендируйте гранулу в разбавленном растворе 7-AAD в соотношении 1 к 20 в буфере FACS.
Перемешайте эту смесь, прежде чем инкубировать ее в течение 10 минут на льду в темной обстановке. Наконец, добавьте в него 200 микролитров буфера FACS и приступайте к анализу образца с помощью проточного цитометра. Анализ жизнеспособности трансдуцированных клеток показал, что на 14-й день более 95% клеток были CD3-положительными и живыми после исключения 7-AAD-положительных клеток, что указывает на успешную активацию и экспансию Т-клеток.
Эффективность трансдукции в CD3-положительной популяции составила 58,7% по сравнению с нетрансдуцированными клетками, которые показали эффективность трансдукции 0,51%Когда трансдуцированные клетки были расширены с четвертого по 14-й день, с субкультивированием каждые два дня, клетки претерпели 25-кратное расширение. Продукт прошел различные испытания по контролю качества и соответствовал всем установленным критериям, свидетельствующим о его пригодности к дальнейшему использованию. Вся процедура должна выполняться строго асептическими методами.
И самым сложным этапом является процесс трансдукции, где нужно учесть все добавляемые реагенты, чтобы поддерживать определенный общий объем.
