Kinetx: un software combinato per il saggio e l'analisi della citometria a flusso per misurare quantitativamente e classificare l'attivazione piastrinica in tempo reale.

Riepilogo

Le piastrine reagiscono rapidamente a una serie di stimoli. Questo articolo descrive un saggio di funzione piastrinica basato sulla citometria a flusso in tempo reale e un software open source su misura di nuova concezione (Kinetx) per consentire misurazioni cinetiche quantitative del rilascio di granuli piastrinici, del legame del fibrinogeno e del flusso intracellulare di calcio.

Abstract

Le piastrine reagiscono rapidamente al danno vascolare e subiscono l'attivazione in risposta a una serie di stimoli per limitare la perdita di sangue. Molti test di funzionalità piastrinica misurano le risposte del punto finale dopo un periodo di tempo definito e non il tasso di attivazione piastrinica. Tuttavia, la velocità con cui le piastrine convertono gli stimoli extracellulari in una risposta funzionale è un fattore essenziale per determinare l'efficienza con cui possono rispondere alle lesioni, legarsi a un trombo in formazione e segnalare di reclutare altre piastrine. Questo articolo descrive un test di funzione piastrinica basato sulla citometria a flusso che consente l'acquisizione simultanea dei dati e la stimolazione del campione e utilizza un software open source su misura di nuova concezione (Kinetx) per consentire misurazioni cinetiche quantitative del rilascio di granuli piastrinici, del legame del fibrinogeno e del flusso intracellulare di calcio. Kinetix è stato sviluppato nel 1999 in modo che gli utenti possano modificare parametri come il grado di livellamento, l'identificazione di punti dati periferici o le scale temporali. Per aiutare gli utenti che non hanno familiarità con l'ambiente R, l'analisi dei dati Kinetix può essere eseguita con un singolo comando. Insieme, ciò consente di misurare e classificare in modo accurato e riproducibile le metriche di attivazione piastrinica in tempo reale, come la velocità, l'accelerazione, il tempo di picco della frequenza di picco, il tempo di picco del calcio e i cambiamenti qualitativi della forma. Le misurazioni cinetiche dell'attivazione piastrinica forniscono una visione unica del comportamento delle piastrine durante le prime fasi dell'attivazione e possono fornire un metodo per prevedere il reclutamento delle piastrine in un trombo in formazione.

Introduzione

Le piastrine svolgono un ruolo centrale nell'emostasi e generano una risposta rapida e multiforme al danno vascolare ^1,2. Gli attuali test di funzionalità piastrinica misurano vari aspetti della reattività piastrinica, rappresentativi delle loro azioni emostatiche in vivo. Tradizionalmente, la funzione piastrinica è stata valutata utilizzando saggi endpoint che misurano il legame del fibrinogeno, il rilascio di granuli o l'aggregazione piastrinica nelle piastrine stimolate per un tempo sufficiente a raggiungere la massima attivazione ^3,4. Questi test non tengono conto del tempo impiegato dalle piastrine per convertire gli stimoli extracellulari in segnali intracellulari e flusso di calcio e successivamente degranulare e legarsi al trombo in crescita. Il sangue scorre a una velocità di taglio fino a 20 dine/^cm3 nelle vene e 80 dine/^cm3 nelle grandi arterie⁵, sottolineando la necessità delle piastrine di contrastare questa rapida velocità di flusso rilevando, elaborando e rispondendo rapidamente agli stimoli extracellulari per legarsi in un trombo in formazione e sostenerne la crescita in corso.

La velocità di attivazione piastrinica può variare indipendentemente dall'entità massima di attivazione piastrinica. La chinasi legata alle integrine (ILK) è una proteina coinvolta nella regolazione delle integrine β1 e β3 nelle piastrine ^6,7. L'inibizione o la delezione specifica di ILK in vivo ha dimostrato che la velocità, ma non l'estensione massima dell'attivazione piastrinica, era influenzata in assenza di ILK⁸ funzionale. Differenze tra il tasso di aggregazione e il livello massimo di aggregazione sono state identificate anche nei topi carenti di CALDAG GEFI ^9,10, una molecola di segnalazione coinvolta nella regolazione della segnalazione inside-out tramite RAP1¹¹.

Questi risultati dimostrano che la frequenza piastrinica e i livelli massimi di attivazione possono essere autonomi e che le misurazioni dell'attivazione massima potrebbero non essere descrittive del comportamento piastrinico fino a questo punto. Queste differenze nel tempo impiegato dalle piastrine per attivarsi possono influenzare profondamente il loro legame iniziale con il trombo in crescita, influenzando l'architettura e le dimensioni complessive del trombo. Queste variazioni tra il tasso piastrinico e l'attivazione massima evidenziano la necessità di un test per misurare con precisione il tasso di attivazione piastrinica e può essere utilizzato per rilevare le variazioni all'interno della popolazione.

Questo articolo descrive un metodo che misura accuratamente l'attivazione piastrinica e il flusso di calcio in tempo reale e calcola una serie di metriche, tra cui la velocità con cui le piastrine si attivano e il tempo impiegato dalle piastrine per raggiungere il tasso massimo di attivazione e il flusso massimo di calcio. Queste misurazioni cinetiche dell'attivazione piastrinica forniscono una migliore comprensione del comportamento delle piastrine durante le prime fasi della formazione dei trombi e forniscono un metodo per prevedere la velocità con cui le piastrine possono essere reclutate in un trombo in formazione.

Protocollo

Questo protocollo ha utilizzato sangue intero umano e piastrine provenienti da donatori sani senza condizioni di salute di base e senza assumere alcun farmaco noto per interferire con la funzione piastrinica dopo il consenso informato scritto ed è stato approvato dal Comitato etico per la ricerca dell'Università di Reading.

1. Raccolta di sangue e preparazione di plasma ricco di piastrine

1. Raccogliere il sangue periferico in un vacutainer contenente il 3,2% di citrato di sodio
2. Scartare i primi 3 ml.
3. Lasciare riposare il sangue a 30 °C per 30 minuti prima della centrifugazione.
4. Preparare il plasma ricco di piastrine (PRP) mediante centrifugazione a 140 x g per 20 minuti a temperatura ambiente prima dell'incubazione a 37 °C per la durata del saggio, che è stata terminata entro 60 minuti dalla centrifugazione.

2. Preparazione dello strumento

NOTA: Un sistema fluidico non pressurizzato è essenziale per la citometria a flusso in tempo reale poiché le piastrine vengono stimolate simultaneamente mentre il citometro a flusso registra gli eventi.

1. Utilizzare un citometro a flusso non pressurizzato per eseguire la citometria a flusso in tempo reale.
2. Per eseguire il test a 37 °C, collegare un tappetino di dissezione per topi al tavolino per posizionare la piastra a 96 pozzetti. Riscaldare il tappetino a 37 °C per tutta la durata del saggio.
3. Posizionare una piastra a 96 pozzetti sopra il tappetino riscaldato per consentire un'incubazione continua a 37 °C (Figura 1)

3. Preparazione del saggio

1. Legame del fibrinogeno ed espressione della P-selectina
   1. Rivestire una piastra per microtitolazione in polipropilene a 96 pozzetti, a fondo tondo, non trattata, con albumina sierica bovina (BSA) al 5% in soluzione salina tamponata Hepes (HBS; 10 mM Hepes pH 7,4; 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄·7H₂0) per una notte a 4 °C.
   2. Preparare la miscela di anticorpi in HBS contenente 5 mM di glucosio (HBS-G). Aggiungere l'anticorpo anti-fibrinogeno marcato con fluoresceina isotiocianato (FITC) (FITC-FGN; diluizione 1: 37,5 (v/v)) e l'anti-P-selectina marcato con alloficocianina (APC-CD62P; diluizione 1: 37,5 (v/v)) a HBS-G (volume finale: 225 μL) e incubare in una piastra a 96 pozzetti a 37 °C .
   3. Immediatamente prima di raccogliere gli eventi, aggiungere PRP alla miscela di anticorpi HBS-G a una diluizione di 1:600 (v/v).
      NOTA: È necessario un basso volume di PRP per garantire che il limite di eventi non venga superato e ridurre l'aggregazione piastrinica nel campione. La diluizione piastrinica è stata esaminata in studi pilota e non influisce sulla velocità di attivazione.
   4. Incubare la miscela di attivazione contenente FITC-FGN, (diluizione 1: 37,5 (v/v)) e APC-CD62P (diluizione 1: 37,5 (v/v)) e agonista a 37 °C. Gli agonisti includono trombina (thr; 0,0012-1 U/mL) in presenza di peptide Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP; 1,18 mM), peptide correlato al collagene reticolato (CRP-XL; 0,004-10 μg/mL), adenosina difosfato (ADP; 0,04-4 μM), epinefrina (epi; 20-200 μM), 9,11-Dideossi-11α,9α-epossimetanoprostaglandina F2α (U46619; 0,02-5 μM) e peptide attivatore del recettore della trombina 6 (TRAP-6; 0,04-10 μM).
2. Flusso di calcio
   NOTA: Questo test è stato eseguito utilizzando un kit di dosaggio del calcio commerciale (Tabella dei materiali)
   1. Rivestire una piastra per microtitolazione in polipropilene a 96 pozzetti, a fondo tondo, non trattata, con il 5% di BSA in soluzione salina tamponata Hepes per una notte a 4 °C.
   2. Per preparare il colorante per il dosaggio del calcio, aggiungere 100 mL di tampone per il dosaggio del calcio e 2 mL di soluzione madre di probenecid (250 mM) a un flacone di reagente di calcio per ottenere 2 volte la soluzione di caricamento del reagente di calcio.
   3. Per preparare Fluo-4/HBS-G, diluire il colorante del saggio del calcio con HBS-G in rapporto 1:1, filtrare attraverso un filtro da 0,22 μM. Aggiungere 225 μl di Fluo-4/HBS-G ai pozzetti appropriati di una piastra a 96 pozzetti a 37 °C.
   4. Incubare il PRP a 37 °C per 30 minuti con una diluizione 1:1 con Fluo-4/HBS-G.
   5. Preparare la miscela di attivazione in Fluo-4/HBS-G e incubare a 37 °C. Gli agonisti includono trombina (1 U/mL) in presenza di GPRP, CRP-XL (0,5 μg/mL), ADP (1 μM), epinefrina (20 μM), U46619 (1 μM) e TRAP-6 (1 μM).
   6. Immediatamente prima di raccogliere gli eventi, aggiungere PRP/Fluo-4/HBS-G ai 225 μL di miscela Fluo-4/HBS-G ad una diluizione finale di PRP (dopo l'aggiunta dell'agonista) di 1:600 (v/v; 0,5 mL in 300 mL del volume finale).

4. Procedura di analisi e raccolta dei dati

1. Impostare il citometro a flusso su una velocità di flusso "lenta" con un numero medio di 1000 eventi al secondo (eps) e un massimo di 3000 eps. Impostare la soglia su 20000 per evitare di registrare detriti di celle.
2. Gate la popolazione piastrinica utilizzando i grafici a dispersione diretta (FSC) e a dispersione laterale (SSC). Per la raccolta dei dati, tracciare FSC-A rispetto a SSC-A per controllare con precisione la popolazione piastrinica e FL1 o FL4 rispetto al tempo per registrare gli eventi fluorescenti nel tempo.
3. Il citometro a flusso impiega 14 s per iniziare a registrare gli eventi; dopodiché, lasciare che lo strumento registri gli eventi in ciascun pozzetto per altri 5 s prima di aggiungere rapidamente 75 μL della miscela di attivazione utilizzando una punta di caricamento in gel per garantire una miscelazione spontanea (Figura 1).
4. Raccogli gli eventi per 5 minuti e imposta i grafici per registrare il canale 488 (FL1; filtro 533/30 - FITC-fibrinogeno/FLUO-4) rispetto al tempo e il canale 633 (FL4; filtro 675/25 - APC-P-selectin) rispetto al tempo.
5. Salva i dati del grafico per i canali 488 e 633 da ciascun pozzetto come file CSV.

5. Analisi dei dati

1. Scarica l'ultima versione di Kinetx¹².
   NOTA: Il download include tutto il codice necessario per analizzare i dati generati dal test ed è accompagnato da una serie di test di dati sperimentali di dieci donatori e output generati dalla loro analisi (questi risultati possono essere rigenerati e convalidati tramite le seguenti procedure) (Figura 2).
2. Configurare l'ambiente R
   1. Utilizzare il linguaggio di programmazione R tramite l'ambiente RStudio. Installa R¹³, RStudio¹⁴ e i seguenti pacchetti: ggplot2, dplyr, plotrix, minpack.lm, tidyverse, psych. Assicurarsi che tutti i pacchetti dei prerequisiti siano stati installati correttamente.
   2. Crea metadati: Posiziona un file di testo (chiamato wellData.txt) all'interno della stessa directory dei dati. Descrive gli agonisti, le loro concentrazioni, eventuali anticorpi e il test (funzione o calcio) utilizzato per generare ciascun file CSV.
   3. Posiziona un secondo file di testo ("IsotypeData.txt") nella stessa directory e definisce gli isotipi. I file forniti nel download ("dati/wellData.txt" e "dati/IsotypeData.txt") possono fungere da modello, essendo facilmente adattabili ad agonisti, inibitori e concentrazioni alternative.
   4. Analizzare i dati: Kinetx comprende tre funzioni come definito nei passaggi 5.2.5-5.2.7.
   5. kinetxProcess.R: questa funzione elabora i dati grezzi della citometria a flusso funzionale. Per eseguire digitare kinetxProcess('data location','where to put outputs','FL1' (per FITC-anti-fibrinogen, o 'FL4' (per APC-CD62P)
   6. kinetxProcessCalcium.R: questa funzione analizza ed etichetta i dati del flusso di calcio. Per eseguire digita kinetxProcessCalcium('data location','where to put outputs','FL1')
   7. kinetxSummary.R: questa funzione riepiloga i dati. Per eseguire, digita kinetxSummary('data location','where to put outputs','FL1').
   8. Per eseguire tutte le funzioni precedenti (5.2.5-5.2.7) sui dati di test, utilizzare lo script (test. R).
      NOTA: Le prime due funzioni producono cifre per ciascun donatore che mostrano i dati grezzi più le curve adattate. Tutti gli output e un foglio di calcolo che riassume i dati vengono posizionati nella posizione di output.

Risultati

L'analisi della citometria a flusso funzionale in tempo reale rivela differenze nella forma delle curve di attivazione tra agonisti e tra donatori
L'analisi dei dati funzionali (esposizione alla P-selectina e legame al fibrinogeno) utilizzando Kinetx rimuove i punti dati che sono al di fuori di intervalli ragionevoli (>200000 o <1) e <2,80 s (il tempo zero è impostato su questo punto), normalizza i dati alla mediana degli isotipi e adatta una curva della media mobile liscia (tramite la funzione loess). Kinetx assegna anche metriche e categorie basate sulla forma della linea levigata adattata, sui valori assoluti e sui tassi di variazione come segue: (1) RoC - aumento medio della linea levigata nei primi 120 s; (2) etichetta - classifica le risposte come veloci, medie o lente in base ai cut-off di 40 e 80 per FL1 e 5 e 10 per FL4; (3) EarlyRoC - aumento medio della linea smussata nei primi 20 secondi; (4) forma - Risposte basse, crescenti, lineari o decrescenti (Figura 3A) - Essendo le risposte basse determinate come FL1 < 4000 o FL4 < 1000, le etichette crescenti, lineari e decrescenti sono determinate in base a: shapeMetric - RoC(120 secondi)/EarlyRoC, dove forma crescenteMetrica >2, forma lineareMetrica tra 0,9-2 e forma decrescenteMetrica <0,9; (5) Produce un foglio di calcolo che riassume i dati fornendo il livello e la velocità di variazione a 0 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 60 s, 90 s, 120 s, 180 s, la mediana dell'isotipo, i tassi massimi e minimi di variazione e accelerazione e tutte le etichette e le categorie.

Il legame piastrinico del fibrinogeno e l'esposizione alla P-selectina oltre 5 minuti dopo l'attivazione in risposta a una singola concentrazione degli agonisti ADP, TRAP-6, CRP-XL, epinefrina e U46617 sono stati analizzati in 30 donatori. Le metriche per il legame del fibrinogeno e l'esposizione alla P-selectina in risposta a diversi agonisti mostrano notevoli variazioni nella forma della risposta (Figura 3). Le piastrine stimolate con TRAP-6 e ADP hanno mostrato un'accelerazione più rapida nel legame del fibrinogeno, che per molti donatori ha rallentato in momenti successivi (Figura 3B). Il legame del fibrinogeno in risposta a CRP-XL, trombina ed epinefrina aveva maggiori probabilità di mostrare un tasso di risposta crescente o lineare. Molti donatori hanno mostrato un tempo di ritardo relativamente lungo per CRP-XL prima che la velocità di legame del fibrinogeno accelerasse rapidamente. La risposta a U46619 è stata spesso classificata come bassa. Al contrario, l'esposizione alla P-selectina aveva maggiori probabilità di mostrare un tasso di risposta lineare o crescente a tutti gli agonisti, ad eccezione di U46619 che mostrava ancora una volta bassi livelli di risposta (Figura 3C).

Il flusso intracellulare di calcio durante l'attivazione piastrinica può essere misurato con precisione utilizzando la citometria a flusso in tempo reale
L'analisi dei dati del saggio del flusso di calcio rimuove i punti dati che sono al di fuori di intervalli ragionevoli (< 2,80 s di tempo zero impostato su questo punto) e quindi inserisce una curva della media mobile liscia (tramite la funzione Loess). Kinetx assegna le metriche e le categorie vengono assegnate in base alla forma delle linee morbide adattate, ai valori assoluti e ai tassi di variazione come segue: (1) categoria - che descrive la forma della risposta del calcio in base all'aumento precoce, al massimo e alla caduta finale dal massimo, descritta come lineare, di picco o sostenuta (Figura 4A); (2) tasso - che descrive il tasso di variazione nei 30 s veloci ed è definito come nessun cambiamento, lento, medio o veloce (con cut-off a 10, 40 e 80). Kinetx produce anche un foglio di calcolo che riassume i dati fornendo il livello e il tasso di variazione a 0 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 60 s, 90 s, 120 s, 180 s, i tassi massimi e minimi di variazione e accelerazione e tutte le etichette e le categorie, oltre a produrre una cifra dei dati per ciascun donatore. Esempi di flusso di calcio misurati con questo metodo in 30 individui hanno mostrato ancora una volta diversi modelli di attivazione tra individui e agonisti (Figura 4B). CRP-XL ha dato una risposta prevalentemente sostenuta al calcio, mentre la risposta a TRAP-6 ha mostrato più spesso una risposta di picco. Tutti gli altri agonisti hanno generato una risposta prevalentemente lineare.

La citometria a flusso in tempo reale identifica le differenze nei livelli massimi di attivazione in risposta a diversi agonisti e concentrazioni
I risultati dimostrano che il test di citometria a flusso in tempo reale ha la capacità di rilevare le differenze nei livelli massimi di legame del fibrinogeno (Figura 5A) e nell'esposizione alla P-selectina (Figura 5D), in risposta alla stimolazione attraverso diversi recettori (10 μg/mL CRP-XL vs. 3 U/mL di trombina P < 0,001; 10 μg/mL CRP-XL vs. 1 U/mL di trombina P < Mostrano anche che il test è sensibile alle differenze di concentrazione degli agonisti, dove i livelli di massimo legame con il fibrinogeno e l'esposizione alla P-selectina sono aumentati in risposta a maggiori concentrazioni di agonisti (legame del fibrinogeno - CRP-XL - 0,004 μg/mL vs. 0,4, 5, 10 μg/mL, P < 0,01; trombina - 0,0012 U/mL vs. 1 e 3 U/mL, P < 0,01; ADP - 0,04 μg/mL rispetto a 1 e 4 μM, P < 0,05).

Il test di citometria a flusso in tempo reale è sufficientemente sensibile da rilevare la variabilità tra i donatori nel tasso di attivazione piastrinica
Il tasso massimo di attivazione piastrinica è stato determinato adattando una media mobile livellata (loess) ai dati di fluorescenza e quindi utilizzandola per calcolare il tasso massimo di legame del fibrinogeno e l'esposizione alla P-selectina (Figura 5B, E). I dati dimostrano una notevole variazione tra i singoli donatori e il test di citometria a flusso è sufficientemente sensibile da rilevare questa variazione. I risultati indicano che l'aumento della concentrazione dell'agonista ha scarso effetto sulla velocità massima di legame del fibrinogeno (Figura 5B). Al contrario, il tasso massimo di esposizione alla P-selectina aumenta con una maggiore concentrazione di trombina e CRP-XL, ma non con l'aumentare delle concentrazioni di ADP (Figura 5E).

Le variazioni del tempo di ritardo dell'attivazione piastrinica possono essere rilevate utilizzando la citometria a flusso in tempo reale
Il tempo al tasso massimo di attivazione piastrinica è stato determinato calcolando i punti temporali in cui è stato raggiunto il tasso massimo di legame del fibrinogeno e l'esposizione alla P-selectina (Figura 5C, F). Il tasso massimo di legame del fibrinogeno e l'esposizione alla P selectina variano tra i donatori, in particolare a concentrazioni più basse di agonisti. La stimolazione delle piastrine con concentrazioni crescenti di CRP-XL mostra che concentrazioni più elevate di agonisti richiedono meno tempo per raggiungere il tasso massimo di legame del fibrinogeno con una minore variabilità tra i donatori; tuttavia, questa tendenza non si osserva né con la stimolazione con trombina né con ADP (Figura 5C). Il test dimostra che in alcune circostanze, l'aumento della concentrazione dell'agonista riduce il tempo impiegato per l'inizio dell'attivazione piastrinica (tempo di ritardo) senza alterare il tasso massimo di attivazione piastrinica e che entrambe queste misure possono essere valutate con questo test.

Figura 1: Citometria a flusso in tempo reale in laboratorio umido. (A) il sangue intero anticoagulato è stato (B) centrifugato per ottenere plasma ricco di piastrine (PRP). (C) Il PRP diluito contenente anticorpi appropriati o coloranti indicatori di calcio è stato posto in una piastra a 96 pozzetti, caricato su un citometro a flusso non pressurizzato e mantenuto a 37 °C utilizzando un tappetino di dissezione. I campioni sono stati stimolati durante l'acquisizione con una miscela di attivazione contenente anticorpi o colorante di calcio e agonista, rapidamente aggiunta al pozzetto utilizzando una punta di caricamento in gel per garantire una miscelazione spontanea. (D) Gli eventi sono stati raccolti per 5 minuti e sono stati salvati i file CSV dei dati per ciascun pozzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Schema dell'analisi dei dati. (A) L'ambiente R è stato configurato e sono stati creati i metadati. (B) I dati periferici sono stati rimossi ed è stata montata una curva della media mobile liscia (loess). (C) Sono stati definiti il tipo di risposta e (D) la forma della risposta. (E) Le metriche sono state calcolate, esportate e le cifre generate per ciascun donatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Output rappresentativo dell'analisi Kinetx del legame piastrinico del fibrinogeno piastrinico in tempo reale e dell'espressione della P-selectina. (A) Oltre a fornire metriche come il tasso massimo di variazione (RoC) e il RoC in vari punti temporali, Kinetx classifica anche la forma della curva per fornire informazioni aggiuntive sull'attivazione delle piastrine che è difficile da catturare in una singola metrica. I dati rappresentativi per 30 individui mostrano la variazione tipica osservata nel legame piastrinico (B) del fibrinogeno e nell'espressione della P-selectina (C) in risposta agli agonisti ADP, TRAP-6, CRL-XL, epinefrina e U46617. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Output rappresentativo dell'analisi Kinetx del flusso di calcio piastrinico in tempo reale. (A) Oltre a fornire metriche come il tasso massimo di variazione (RoC) e il RoC in vari punti temporali, Kinetx classifica anche la forma della curva del flusso di calcio per fornire informazioni aggiuntive sull'attivazione delle piastrine che è difficile da catturare in una singola metrica. I dati rappresentativi per 30 individui mostrano la variazione tipica osservata nel flusso di calcio piastrinico (B) in tempo reale in risposta agli agonisti ADP, TRAP-6, CRL-XL, epinefrina e U46617. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: La concentrazione dell'agonista determina la massima attivazione piastrinica ma non la velocità di attivazione piastrinica. L'attivazione piastrinica massima - legame del fibrinogeno (A) o esposizione alla P-selectina (D) - è stata significativamente alterata positivamente dalla concentrazione dell'agonista (CRP-XL, trombina o ADP). Il tasso di attivazione piastrinica (B ed E) e il tempo al tasso massimo di attivazione piastrinica (C e F) non hanno mostrato alcuna relazione o una relazione più debole con la variazione della concentrazione dell'agonista. I valori P mostrano la significatività nell'intero intervallo di concentrazione (test di Kruskal-Wallis) e gli asterischi indicano una differenza significativa (test di confronto multiplo) dei singoli valori rispetto alla concentrazione più bassa. * P < 0,05, ** P < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La velocità con cui le piastrine rilevano, elaborano e rispondono agli stimoli attivanti può essere un determinante essenziale per la formazione di trombi. Studi precedenti hanno scoperto che l'inibizione degli elementi di segnalazione che influenzano la velocità, ma non l'entità finale dell'attivazione piastrinica, provoca la formazione di trombi⁸ instabili. Molti saggi di funzionalità piastrinica misurano l'entità dell'attivazione e dell'aggregazione piastrinica in risposta a diverse condizioni e trattamenti; Tuttavia, questi non considerano la velocità con cui le piastrine si attivano e il tempo impiegato^{per questo complesso} processo ^3,4. Gli innovativi saggi basati sulla citometria a flusso sviluppati in questo studio monitorano in modo riproducibile l'attivazione piastrinica nel tempo e la traducono in una serie di metriche per calcolare il tasso massimo di attivazione piastrinica e il tempo impiegato dalle piastrine per raggiungere questo tasso massimo e attivarsi completamente.

I dati presentati evidenziano la capacità del test in tempo reale di identificare le variazioni tra le diverse risposte al tipo di agonista e alla concentrazione e tra gli individui. Molti rapporti precedenti hanno dimostrato che la reattività piastrinica è altamente variabile tra individui normali^15,16, indicando che il tasso di attivazione piastrinica può anche variare significativamente all'interno della popolazione. I dati di questo studio dimostrano che il tasso di degranulazione e di legame del fibrinogeno alle piastrine sembra essere ancora più variabile dei livelli massimi di attivazione piastrinica. Ciò dimostra che la citometria a flusso in tempo reale può essere utilizzata anche come strumento prezioso e affidabile per identificare le variazioni del tasso piastrinico nella popolazione e rilevare gli effetti di diversi agenti inibitori o pro-attivatori sul tasso piastrinico come mezzo aggiuntivo per misurare la funzione piastrinica.

Quando la funzione piastrinica viene misurata utilizzando saggi endpoint, è possibile effettuare confronti sull'entità del legame del fibrinogeno o del rilascio di granuli tra diversi agonisti. Le curve di loess che confrontano il legame del fibrinogeno nei primi 5 minuti di attivazione piastrinica dimostrano la capacità del test in tempo reale di evidenziare maggiori dettagli nelle differenze nella cinetica di attivazione piastrinica che i saggi a singolo endpoint non possono misurare.

I dati raccolti dal test in tempo reale dimostrano che la velocità con cui il fibrinogeno si lega alle piastrine segue uno schema leggermente diverso, a seconda della via di attivazione (Figura 3). Per valutare con precisione la cinetica di attivazione piastrinica, è essenziale utilizzare un citometro a flusso non pressurizzato che consenta l'acquisizione simultanea dei dati e la stimolazione del campione. È inoltre essenziale che gli agonisti vengano aggiunti rapidamente per garantire una miscelazione quasi istantanea e completa di agonista e piastrine. La stimolazione con trombina ADP ed epinefrina produce una curva simile che rappresenta un rapido inizio della segnalazione in risposta alla sensibilizzazione del recettore, con conseguente legame del fibrinogeno alle piastrine a una velocità rapida e costante. Al contrario, le piastrine stimolate da CRP-XL sono inizialmente molto lente a legare il fibrinogeno dopo la sensibilizzazione iniziale del recettore; Tuttavia, la velocità di legame del fibrinogeno aumenta rapidamente dopo questo ritardo iniziale. La stimolazione piastrinica con U46619, un mimetico di TXA2, si traduce in un rapido tasso iniziale di legame del fibrinogeno, che diminuisce rapidamente a un ritmo molto lento portando solo a un leggero e costante aumento del legame del fibrinogeno nel tempo.

Kinetx è stato progettato per essere open-source, riproducibile e facile da implementare al fine di aggirare i problemi con il software proprietario, come i costi e la mancanza di flessibilità. In quanto tale, doveva essere sviluppato con software non proprietario. R è stato scelto perché è ampiamente utilizzato dai biologi, facile da installare, gratuito e open-source. Questo ambiente open source consente agli utenti esperti in R di modificare parametri come il grado di livellamento, l'identificazione di punti dati periferici o le scale temporali. Tuttavia, per aiutare i ricercatori che non hanno familiarità con R, Kinetix è stato sviluppato anche in modo che l'analisi possa essere eseguita tramite un singolo comando (kinetxProcess o kinetxProcessCalcium, a seconda dei dati analizzati). Il software Kinetix qui illustrato è in grado di calcolare una serie di metriche, inclusi i valori per i livelli massimi, la velocità e l'accelerazione del legame del fibrinogeno o dell'esposizione alla P-selectina e i punti temporali in cui si verificano questi massimi. La cinetica dell'attivazione piastrinica in risposta a diverse vie di stimolazione può essere confrontata in modo più accurato utilizzando questi numeri.

I confronti tra diverse stimolazioni agonistiche nei livelli massimi di legame del fibrinogeno e i tassi di legame del fibrinogeno alle piastrine sono buoni esempi di dove il tasso di attivazione piastrinica può variare indipendentemente dal legame massimo. Confrontando il massimo legame del fibrinogeno dopo 5 minuti di stimolazione con 0,04 μM di ADP (3,85 LogFU) e 0,04 μg/mL CRP-XL (3,70 LogFU), entrambi gli agonisti hanno portato a una quantità simile di fibrinogeno legato (Figura 5A). I tassi massimi di legame del fibrinogeno mostrano una differenza ancora più piccola (0,04 μM ADP - 0,0050 LogFU/minuto; 0,04 μg/mL CRP-XL - 0,0054 LogFU/min), indicando che il tasso complessivo di legame del fibrinogeno è simile tra queste due stimolazioni (Figura 5B). Tuttavia, quando si confronta il tempo di ritardo dell'attivazione piastrinica, c'è una chiara differenza che mostra che CRP-XL (117 s alla velocità massima) accelera a una velocità molto più lenta rispetto all'ADP (47 s alla velocità massima) (Figura 5C). Pertanto, diventa chiaro che la stimolazione con ADP si traduce in una risposta iniziale molto più rapida (P < 0,001) rispetto alla CRP-XL. Se osservate insieme, queste misurazioni della cinetica piastrinica in risposta a due diversi agonisti descrivono una rapida risposta iniziale alla stimolazione dell'ADP che accelera lentamente e rimane a un ritmo costante. Al contrario, la stimolazione di CRP-XL si traduce in un lento tasso iniziale di attivazione, che accelera rapidamente in un momento molto più tardivo, portando infine a un tasso complessivo e a livelli di legame del fibrinogeno simili a quelli dell'ADP. Queste differenze tra i livelli massimi, la velocità e l'accelerazione del legame del fibrinogeno dimostrano che una serie di parametri sono coinvolti nella misurazione della velocità con cui le piastrine si attivano. Il saggio in tempo reale e l'analisi Kinetx possono misurare e confrontare questi parametri, descrivere il tempo impiegato dalla sensibilizzazione del recettore alla risposta piastrinica e confrontarlo tra diverse vie di segnalazione.

L'aumento della concentrazione dell'agonista non ha un effetto significativo sulla velocità di legame del fibrinogeno alle piastrine. Tuttavia, il tempo impiegato per raggiungere il tasso massimo di legame del fibrinogeno diminuisce all'aumentare della concentrazione dell'agonista, suggerendo che le piastrine legano il fibrinogeno a una velocità costante e la saturazione del recettore gioca un ruolo più importante nella velocità con cui le piastrine legano il fibrinogeno.

Il saggio e l'analisi del flusso di calcio descritti sono un saggio del calcio rapido e facile da eseguire che può essere incorporato come campioni extra nel test in tempo reale, consentendo l'analisi del legame del calcio e del fibrinogeno piastrinico e della P-selectina nella stessa serie di campioni. Il pacchetto di analisi su misura fornisce una valutazione approfondita della cinetica del flusso di calcio, compresa la forma della risposta, la risposta massima e il tempo per ottenere la risposta massima. Questi parametri possono quindi essere confrontati per la variazione tra i donatori e in risposta a vari agenti farmaceutici. Il flusso di calcio nelle piastrine è stato precedentemente studiato nelle piastrine utilizzando una varietà di saggi basati sulla citometria a flusso 17,18,19. Aliotta et ^al.14, descrivono un saggio elegante in grado di analizzare la cinetica di più ioni intracellulari. Il test del calcio qui presentato si basa su questi test pubblicati in precedenza, includendo il pacchetto di analisi che consente una maggiore flessibilità, un'esplorazione più approfondita dei dati con il vantaggio di un'analisi ad alto rendimento per più donatori in un breve lasso di tempo.

Studi precedenti hanno dimostrato che l'inibizione o l'assenza di alcune molecole di segnalazione provoca un'alterazione del tasso di attivazione piastrinica, che si traduce direttamente nella formazione di trombi ^8,9. In passato, la cinetica di attivazione piastrinica poteva essere misurata mediante citometria a flusso su un numero di punti temporali fissi che possono quindi essere utilizzati per calcolare e confrontare, ad esempio, il tasso di esternalizzazione di GPIIbIIIa in risposta a diversi agonisti²⁰. Il saggio in tempo reale e l'analisi Kinetx descritti in questo documento forniscono un metodo semplice, disponibile gratuitamente e accurato per misurare sia la velocità che il punto finale dell'attivazione piastrinica dalle piastrine a riposo. Questo è probabilmente importante per identificare le variazioni fisiologicamente rilevanti nella funzione piastrinica che possono essere perse quando vengono misurate solo le letture degli endpoint.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
9,11-Dideoxy-11α,9α-epoxymethanoprostaglandin F2α - U46619	Sigma-Aldrich, Poole, UK	D8174-1MG
Accuri C6 flow cytometer with BD Csampler	Beckton Dickinson, UK	660517 + 660519
Adenosine diphosphate	Sigma-Aldrich, Poole, UK	A2754-1G
APC-labelled anti-P-selectin (CD62p)	BD Biosciences, UK	550888
Corning polypropylene 96-well round-bottomed, non-treated microtitre plate	Sigma-Aldrich, Poole, UK	CLS3879-50EA
Cross-linked collagen related peptide (CRP-XL)	CambCol, UK
Epinephrine	Sigma-Aldrich, Poole, UK	E4375-1G
FITC-labelled anti-fibrinogen antibody	Dako, Agilent Technologies, UK	F011102-2
Fluo-4 Direct dye	Thermo-Fisher Scientific	F10472
Gel loading tips	Starlab, UK	I1022-0600
Gly-Pro-Arg-Pro peptide	Sigma-Aldrich, Poole, UK	G1895-5MG
Thrombin	Sigma-Aldrich, Poole, UK	SRE0003-10KU
Thrombin receptor activator peptide 6 (TRAP-6)	Bachem, St Helens, UK	H-2936.0005
Vacuette 9NC coagulation 3.2 % trisodium citrate (0.109 mol/L)	Greiner Bio-one LTD, Stonehouse, UK	454327