Puntura modificata della vena della coda e della vena del pene per il prelievo di sangue nel modello di ratto

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per offrire alternative di raccolta del sangue rapide, facili e affidabili per il modello di ratto. Descriviamo tre diversi metodi di prelievo del sangue in base al contesto: puntura della vena della coda in anestesia o su un animale cosciente e puntura della vena del pene dorsale in anestesia.

Abstract

I campioni di sangue sono richiesti nella maggior parte dei progetti di animali sperimentali per valutare vari parametri ematologici. Questo documento presenta due procedure per la raccolta del sangue nei ratti: la puntura della vena laterale della coda e la puntura della vena del pene dorsale, che offrono vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche precedentemente descritte. Questo studio mostra che queste due procedure consentono un campionamento rapido (meno di 10 minuti) e producono volumi di sangue sufficienti per la maggior parte dei test (202 μL ± 67,7 μL). La puntura della vena dorsale del pene deve essere eseguita in anestesia, mentre la puntura della vena laterale della coda può essere eseguita su un animale cosciente e trattenuto.

L'alternanza di queste due tecniche, quindi, consente il prelievo di sangue in qualsiasi situazione. Mentre è sempre consigliabile che un operatore sia assistito durante una procedura per garantire il benessere degli animali, queste tecniche richiedono un solo operatore, a differenza della maggior parte dei metodi di prelievo del sangue che ne richiedono due. Inoltre, mentre questi metodi precedentemente descritti (ad esempio, bastone giugulare, prelievo di sangue della vena succlavia) richiedono un ampio addestramento preliminare per evitare danni o morte dell'animale, la puntura della vena caudale e della vena dorsale del pene sono raramente fatali. Per tutti questi motivi, e a seconda del contesto (ad esempio, per studi che includono ratti maschi, durante il periodo perioperatorio o immediatamente postoperatorio, per animali con sottili vene della coda), entrambe le tecniche possono essere utilizzate alternativamente per consentire ripetuti prelievi di sangue.

Introduzione

Il prelievo di sangue è necessario per la maggior parte degli studi sugli animali, sia in vivo che in vitro. Nei ratti, poiché la frequenza e la quantità di prelievo di sangue possono essere significative, è utile avere diverse alternative per la raccolta. Vari metodi sono stati descritti in studi precedenti.

Le tecniche più comunemente usate sono la puntura della vena caudale e il prelievo di sangue della vena safena. Il campionamento delle vene della coda è adatto a tutti i ceppi di ratto. Con un addestramento adeguato, la procedura è semplice da eseguire e causa un disagio minimo all'animale¹. Allo stesso modo, il prelievo di sangue della vena safena, a condizione che sia fatto correttamente, è anche un metodo di raccolta rapido e semplice. Nessuno dei due metodi richiede l'anestesia ed entrambi consentono prelievi ripetuti di piccole quantità di sangue. Tuttavia, la puntura della vena safena di solito produce un volume di sangue inferiore¹ e richiede la presenza di due persone per lasciare un arto posteriore esposto per la puntura².

Se è necessario raccogliere grandi quantità di sangue da un singolo animale, è possibile utilizzare la puntura cardiaca o la puntura della vena cava (fino a 10 ml di sangue possono essere prelevati da un ratto da 150 g con puntura cardiaca²). Queste tecniche richiedono l'anestesia e sono procedure terminali. L'animale deve essere eutanasia dopo una di queste due tecniche². Il bastone giugulare è un'alternativa che può essere utilizzata se è necessario raccogliere grandi quantità di sangue in uno studio che non ha ancora raggiunto il suo endpoint. Tuttavia, questa tecnica richiede anche notevoli abilità tecniche per evitare danni all'animale; Pertanto, il suo uso dovrebbe essere limitato³.

Altre tecniche, come il prelievo di sangue della vena succlavia, non richiedono l'uso di anestetici prima della raccolta del sangue e consentono il campionamento ripetuto di piccoli volumi di sangue. Tuttavia, per questa tecnica sono necessarie una manipolazione moderata e un'appropriata incisione dell'ago. Un'operazione impropria può causare dolore animale o addirittura mortalità, e l'addestramento per questo metodo può essere meticoloso⁴.

Altre procedure aneddotiche includono la puntura orbitale e la puntura della vena sublinguale, entrambe le quali richiedono un anestetico, e non sono raccomandate né ampiamente utilizzate. Sebbene studi precedenti abbiano dimostrato una raccolta di sangue più rapida mediante puntura orbitale rispetto alla puntura della vena caudale, è stato riscontrato che la puntura orbitale in anestesia dietil-etere era meno ben tollerata rispetto a quest'ultimo metodo (basato sui punteggi di eccitazione degli animali e sulla produzione di urina)⁵. Inoltre, questo metodo è fortemente influenzato dall'abilità della persona che esegue la procedura e viene eseguito principalmente da veterinari esperti. Comparabilmente, la puntura venosa sublinguale è meno angosciante ed è raccomandata per il prelievo di sangue ripetuto⁶. Tuttavia, questa tecnica presenta gravi effetti avversi come una ridotta assunzione di cibo e acqua, che può portare alla morte dell'animale⁷.

Questo studio descrive due metodi utilizzati nel nostro laboratorio per il prelievo di sangue ripetuto. La puntura della vena della coda può essere eseguita su un animale cosciente e il danno tissutale e gli effetti avversi sono minimi. La modifica di questa tecnica in questo studio include la stabilizzazione della coda con l'indice e il medio, che consente a un singolo operatore di eseguire la raccolta del sangue. La puntura della vena del pene dorsale è già stata descritta per semplici iniezioni endovenose. Questa tecnica viene eseguita in anestesia e consente una fonte di sangue affidabile in caso di difficoltà con altri metodi (ad esempio, durante l'immediato periodo postoperatorio, con un piccolo animale, quando si esegue il prelievo di sangue perioperatorio in anestesia). Analogamente al campionamento delle vene caudali, la lesione nel sito di puntura avrà un effetto complessivo minore sull'animale rispetto alle tecniche sopra menzionate⁸. Lo scopo di questo documento sui metodi è quello di offrire ai ricercatori inesperti alternative di campionamento del sangue semplici e affidabili in base al contesto (ad esempio, per procedure eseguite in anestesia, per studi che includono ratti maschi, per animali con vene caudali sottili).

Protocollo

Le procedure sono state eseguite su ratti Lewis maschi di 3 mesi, ciascuno del peso di 300-400 g. Sono stati inclusi un totale di 24 animali, con tre condizioni di puntura: 12 ratti sono stati sottoposti a puntura della vena caudale senza anestesia (gruppo TV senza anestesia) e altri 12 ratti sono stati anestetizzati per sottoporsi sia alla puntura della vena caudale (gruppo TV con anestesia) che alla puntura della vena del pene (gruppo PV con anestesia). Tutte le procedure sono state approvate e hanno rispettato le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutti gli animali sono stati eutanizzati alla fine dello studio (dopo un follow-up di 1 mese) per overdose di anidride carbonica. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Orientamenti generali

1. In linea con le linee guida IACUC, assicurarsi che il volume massimo di sangue prelevato non sia superiore al 10% del volume totale del sangue ogni 2 settimane⁹. Ad esempio, un ratto di 300 g dovrebbe avere un volume totale di sangue di circa 19,2 ml. Nel caso di un protocollo che richiede quattro prelievi di sangue nella sola prima settimana (giorno 0, giorno 1, giorno 3, giorno 7), limitare la raccolta a un massimo di 250 μL di sangue per campione.
2. Per le procedure eseguite in anestesia, somministrare isoflurano tramite un vaporizzatore di precisione per anestetizzare l'animale. Indurre l'anestesia in una camera con una dose di isoflurano al 3% -5% per 5 minuti e mantenere utilizzando una dose di isoflurano all'1% -3% attraverso un cono nasale durante la procedura. Regolare il livello di isoflurano in base al monitoraggio continuo della frequenza respiratoria. Verificare se la sedazione è sufficiente con il pizzico del dito prima di iniziare la procedura.
3. Non lasciare l'animale incustodito durante la procedura o fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la reclinazione sternale.
4. Dopo la raccolta del sangue, monitorare l'animale fino al completo recupero prima di riportarlo nella sua gabbia e non introdurlo in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ristabilito.
   NOTA: In accordo con i servizi veterinari, non era necessario alcun farmaco antidolorifico post-procedura dopo la puntura della vena della coda o della vena del pene.

2. Prelievo di sangue dalla vena del pene

1. Preparazione
   1. Preparare la seguente attrezzatura: garza sterile, guanti, salviette imbevute di alcool, un tubo EDTA per la raccolta di sangue microcapillare (cappuccio viola) e una siringa da insulina da 30 G (30 U o 50 U).
   2. Estrarre il topo dalla sua gabbia e metterlo in una camera per l'induzione con isoflurano tramite un vaporizzatore di precisione (dose: 3% -5%). Una volta che l'animale è sedato, trasferirlo sul tavolo della procedura e appoggiare l'animale sulla schiena con il naso posizionato nel cono del naso per mantenere l'anestesia. Monitorare la frequenza respiratoria e regolare di conseguenza il livello di isoflurano (dose di mantenimento: 1% -3%). Verificare che l'animale sia sufficientemente sedato dalla punta del piede prima di iniziare la procedura.
2. Prelievo di sangue
   1. Spostare lo stantuffo avanti e indietro nella siringa più volte per attenuare il prelievo. Creare una pressione negativa nella siringa tirando lo stantuffo per rimuovere un paio di microlitri.
   2. Con l'aiuto della mano non dominante, ritrarre il prepuzio dalla fine del pene e tenere il glande tra l'indice e il pollice, tirando delicatamente. La vena dorsale del pene apparirà come un cordone blu superficiale. Vedere la Figura 1 e la Figura 2.
   3. Con la cruna dell'ago rivolta verso l'alto, inserire la siringa da insulina nella vena con un angolo di 35°. Una volta che l'ago è entrato nella vena, il sangue fluirà nella siringa.
   4. Estrarre lentamente lo stantuffo della siringa a una velocità lenta e costante per raccogliere il volume desiderato.
      NOTA: Non estrarre lo stantuffo troppo velocemente, poiché ciò causerebbe il collasso della vena e interromperebbe il flusso sanguigno.
   5. Se il flusso sanguigno diminuisce, ruotare leggermente l'ago in senso orario o antiorario.
   6. Rimuovere la siringa. Una goccia di sangue si formerà sul sito di puntura, la cui aspirazione consentirà la raccolta di qualche microlitro in più di sangue nel caso di una procedura non sterile.
   7. Se la prima puntura fallisce, reinserire l'ago più prossimalmente sulla vena.
      NOTA: A differenza del campionamento delle vene della coda, la puntura iterativa della vena dorsale del pene di solito non ha successo.
   8. Applicare una leggera pressione sul sito di puntura per fermare l'emorragia e pulire l'area con una nuova salvietta imbevuta di alcool.
   9. Rimetti il pene nella sua posizione neutra.
   10. Spegnere l'isoflurano e monitorare il ratto fino al completo recupero. Riporta il topo nella sua gabbia.

3. Puntura della vena della coda

1. Preparazione
   1. Preparare la seguente attrezzatura: un supporto di contenimento in plastica, una garza sterile, guanti, salviette imbevute di alcool, un tubo EDTA per la raccolta del sangue microcapillare (cappuccio viola) e una siringa da insulina da 28 G 1/2 (30 U o 50 U).
   2. Porta il topo fuori dalla sua gabbia e fissalo rapidamente in un cono di contenimento di plastica. Chiudere la grande estremità del cono attorno alla base della coda. Assicurarsi che l'animale sia a suo agio e che la respirazione sia illimitata durante l'intera procedura.
   3. Immergere la coda in acqua tiepida (37 °C) per circa 1 minuto per dilatare la vena. Asciugare la coda con un tovagliolo di carta. Posizionare l'animale (nel suo contenitore) a faccia in giù, con la coda sdraiata su una piastra elettrica.
   4. Selezionare la vena caudale destra o sinistra (linea blu) per il campionamento ruotando l'intero animale su entrambi i lati (questo evita la torsione della coda). Utilizzare il terzo terminale della coda per la perforazione dei vasi sanguigni poiché i vasi diventano più superficiali in questa zona. L'arteria è ventrale e le due vene sono laterali¹⁰.
   5. Pulire la coda con salviette etanolo al 70% nel sito di puntura.
   6. Posizionare la coda sul bordo della piastra riscaldante per creare un angolo nel terzo terminale della coda. Questo porta la vena in superficie e crea più spazio per prelevare il campione.
2. Prelievo di sangue
   1. Spostare lo stantuffo avanti e indietro nella siringa più volte per attenuare il prelievo. Creare una pressione negativa nella siringa tirando lo stantuffo per rimuovere un paio di microlitri.
   2. Con l'aiuto dell'indice e del dito medio non dominanti, fissare la coda piatta sul termoforo. Posizionare il dito medio prossimalmente e l'indice distale, con il sito di puntura tra queste due dita. Applicare più pressione sul dito medio che sull'indice per fissare la coda, occludendo il vaso solo prossimalmente e permettendo al sangue di accumularsi. Vedere la Figura 1 e la Figura 3.
   3. Con la cruna dell'ago rivolta verso l'alto, far scorrere la siringa da insulina contro l'indice fino a inserirla nella vena (questo crea un angolo di 35° tra l'ago e la coda). Una volta che l'ago è entrato nella vena, il sangue fluirà nella siringa. A questo punto, rilasciare la pressione sull'indice e sul medio per assicurarsi che il flusso sanguigno non sia occluso.
   4. Prelevare lentamente lo stantuffo della siringa a una velocità costante per raccogliere il volume desiderato.
      NOTA: non estrarre lo stantuffo troppo velocemente; Ciò causerà il collasso della vena e fermerà il flusso sanguigno.
   5. Se il flusso sanguigno diminuisce, ruotare leggermente l'ago in entrambe le direzioni.
   6. Rimuovere la siringa dalla coda. Una goccia di sangue si formerà sul sito di puntura della coda. L'aspirazione di questo sangue consente la raccolta di qualche microlitro in più di sangue nel caso di una procedura non sterile.
   7. Se la prima puntura fallisce, reinserire l'ago più prossimalmente sulla vena.
      NOTA: La vena diventa progressivamente più profonda man mano che si avvicina alla base della coda. Se non c'è flusso sanguigno nella siringa, aumentare l'angolo tra la siringa e la coda, o ruotare l'ago.
   8. Applicare pressione sul sito di puntura per fermare l'emorragia e pulire l'area con una nuova salvietta imbevuta di alcool. Rimuovere il topo dal cono di plastica e riportarlo nella sua gabbia.
3. Puntura della vena della coda in anestesia
   1. Eseguire il passaggio 2.1.1 e il passaggio 2.1.2 per indurre e mantenere l'anestesia.
   2. Eseguire i passaggi 3.1.3-3.2.7 per la raccolta del sangue; vedere la Figura 1.
   3. Eseguire il passaggio 2.2.10 per il recupero degli animali.

Figura 1: Schemi dei diversi metodi di puntura in questo protocollo. (A) Puntura modificata della vena della coda su un animale cosciente e trattenuto; (B) puntura modificata della vena della coda e puntura della vena del pene sotto anestesia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

Il successo è stato definito come un prelievo di sangue che produce almeno 100 μL di sangue in meno di 10 minuti (dal tempo di puntura alla fine della raccolta del sangue), e il fallimento è stato definito come un prelievo di sangue che produce meno di 100 μL di sangue o impiega più di 10 minuti per recuperare il volume di sangue richiesto. Era consentito un massimo di 250 μL di sangue per campione. Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando un test ANOVA unidirezionale per confronti multipli e il test ...

Discussione

La puntura della vena della coda è un metodo efficace per ottenere sangue da un ratto cosciente. Tuttavia, quando un animale è sotto anestesia, l'effetto dell'isoflurano può portare a spasmi vascolari e rendere inadatta la puntura della vena della coda¹¹. Come dimostrato in questo studio, un'alternativa in questa situazione è quella di raccogliere il sangue dalla vena del pene, che ha più successo e produce un volume significativamente maggiore di sangue in meno tempo. È importante ricordare...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL | 28 G ½  Insulin Syringes	BD	329424	for tail vein puncture
0.5 mL | 30 G x 5/16 Insulin Syringes	BD	320468	for penile vein puncture
250 L  Microtainer blood collection tubes with K2EDTA	BD	365974
Gauze Sponges	Curity	6939
Isoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine	E-Z Systems	EZ-190F	for penile vein puncture
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	1403-704-06	for penile vein puncture
Nosecone for Anesthesia	World Precision Instruments	EZ-112	for penile vein puncture
Rodent Restraint Cone	Harvard Apparatus	ST2 52-95-86	for tail vein puncture
Small Animal Heated Operating Table (Adjustable)	Peco Services Ltd	69023
Webcol Alcohol prep pads	Simply Medical	5110