Ringraziamo il Dott. Jennifer Emtage per la lettura critica del manoscritto, Ryan Gill per l&#39;assistenza tecnica e aiutare con cura zebrafish e il Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) per i reagenti. Il nostro lavoro è stato sostenuto da Temple University College di Scienza e Tecnologia e il National Institutes of Health (R01-HD061749).

1. La produzione del F0 Generation di microiniezione della Trappola Gene. Abbiamo scoperto che gli embrioni di diverse origini genetiche mostrano diverse tolleranze di questa procedura, con il tipo selvatico pet-store-based e Tuebingen - Long Fin (TLF) è la più tollerante mentre i ceppi AB e Tuebingen hanno più poveri la sopravvivenza. <ol><li> Preparazione del trasposone DNA. Preparare GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. In preparazione) DNA plasmidico utilizzando il kit QIAprep miniprep standard (Qiagen 27106). È essenziale includere la fase di lavaggio PB (che è opzionale in procedura QIAprep), altrimenti il DNA miniprep sarà contaminato da RNasi A, che porta alla degradazione dell&#39;mRNA transposase. Prima dell&#39;iniezione, diluire il DNA in acqua RNase-free (Ambion AM9937) a 10 ng / ml. </li><li> Preparazione di transposase mRNA. Linearizzare pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 utilizzando XbaI e trascrivere il DNA linearizzato utilizzando una macchina T3 mMessage(Ambion AM1348) nel kit di trascrizione in vitro. Abbiamo modificato la reazione di trascrizione in vitro con l&#39;aggiunta di 0,5 ml di inibitore RiboLock RNasi (ThermoFisher Fermentas EO0381). Dopo la fase di trattamento DNasi, purificare mRNA utilizzando un kit RNeasy MinElute (Qiagen 74.204). Valutare la qualità del mRNA in vitro trascritto mediante elettroforesi su gel di agarosio. Diluire il mRNA in acqua RNase-free a 40 ng / ml, e negozio come due aliquote microlitri a -80 ° C. </li><li> Preparazione della miscela microiniezione. Prima dell&#39;iniezione, aggiungere 8 ml di diluito DNA trasposone ad una aliquota 2 microlitri di transposase mRNA. </li><li> Microiniezione. Iniettare 3 nl di miscela di DNA / RNA nel tuorlo di 1 embrioni di zebrafish cella utilizzando tecniche standard di microiniezione, puntando per l&#39;interfaccia tuorlo / blastomeri. Raccogliere gli embrioni ogni 20 min per assicurare l&#39;iniezione in 1 fase delle cellule. Nella nostra esperienza, una persona abile può facilmente iniettare 1.000 embrioni in 1-1.5 ore. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, eseguire 5 ml di sinistraoltre soluzione iniettabile su un gel di agarosio 1% per il controllo di qualità, per garantire che l&#39;mRNA transposase non è degradata. </li><li> Cura embrione iniettato. Nel tardo pomeriggio, rimuovere gli embrioni non fecondate e anormali e distribuire gli embrioni di 60-80 per 100 millimetri piatto di Petri. Embrioni anormali e morte vengono rimosse al 1 ° giorno dopo la fecondazione (dpf), 2 dpf e 3 dpf. </li><li> Screening per l&#39;espressione GFP. Embrioni schermo senza difetti evidenti per GFP fluorescenza a 3 dpf (Figura 3). Lo screening può essere effettuato sia in uno stereomicroscopio dotato di fluorescenza (Nikon usiamo un SMZ1500) o su un microscopio verticale (usiamo un Zeiss AxioImager con un obiettivo 5X Fluar). Bassa espressione GFP indica o iniezione riuscita o degrado della trasposasi RNA a causa della contaminazione RNasi (Figura 3A). Selezionare circa il 30% degli embrioni brillanti che hanno o espressione GFP in diversi tessuti o in una elevata percentuale di cellule di un tessuto specifico (confrontare Figures 3B e 3C). Da una iniezione di 1.000 embrioni, di solito abbiamo fino a 100 evolutivamente-normale, alta-GFP che esprimono embrioni. </li><li> Sollevare embrioni F0 selezionati con procedure zebrafish allevamento standard. E &#39;ragionevole aspettarsi che il 20-30% degli embrioni iniettati selezionati per l&#39;allevamento potrà sopravvivere fino all&#39;età adulta. </li></ol> 2. Manutenzione degli UAS: MRFP Tester Line. Abbiamo generato una 14xUAS: linea MRFP segnata da γCry specifico obiettivo: GFP. Poiché UAS è soggetto a tacere attraverso la metilazione del DNA, è importante selezionare il pesce con bassi livelli di tacere per propagare il brodo. <ol><li> Impostare UAS individuale: omozigoti MRFP per l&#39;accoppiamento con una delle nostre linee più affidabili trappola gene GAL4, tpl6 NSF (Balciuniene et al in preparazione.). </li><li> Il giorno successivo, trasferire i UAS: pesce MRFP che hanno dato gli embrioni a singoli serbatoi statici, mentre gli embrioni sono raccoltie puliti. </li><li> Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf e 3 dpf. </li><li> Pesce intercross che ha dato embrioni con elevata espressione MRFP per stabilire la prossima generazione di UAS: linea MRFP. </li></ol> 3. Proiezione del F0 Pesce. <ol><li> Croce F0 individuale con il UAS omozigote: MRFP pesce (Figura 4). Noi di solito iniettiamo nostri GBTS in linee con wild-type o leopardo pigmentazione modelli, e le nostre UAS omozigoti: linea MRFP è in ottone background. Pertanto pesce F0 GBT-iniettato può essere facilmente distinguibili dalle UAS: MRFP pesce, eliminando la necessità di registrare se il F0 essere proiettato era un maschio o una femmina così come potenziali errori derivanti da errori di registrazione e / o determinare il sesso ogni pesce. Il personale con esperienza molto limitata, tali noi studenti universitari, sono quindi in grado di impostare e abbattere accoppiamenti di pesce. Questo approccio ha lo svantaggio che due diversi background genetici sonoin uso, potenzialmente complicando interpretazione di perdita di fenotipi funzionali. </li><li> Il giorno successivo, restituire le UAS in ottone: MRFP pesce per loro serbatoio. Mettere il pesce F0 che ha dato embrioni in singoli serbatoi statici (usiamo Hagen Exo Terra Faunarium Piccolo, ma ogni piccolo serbatoio può essere utilizzata per questo scopo), mentre gli embrioni sono raccolti e proiettati. </li><li> Pulire e trasferimento embrioni raccolti in nuove piastre di Petri (&lt;100 a piatto), nel pomeriggio del giorno 0. </li><li> Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf, 2 dpf e 3 dpf. Tirare embrioni positivi sia per GFP e RFP fuori, ordinarli per GFP / RFP pattern di espressione (se più di un modello si osserva in una frizione) e sollevare loro di stabilire generazione F1. </li><li> Euthanize il pesce F0 che produceva soltanto embrioni negativi (su un numero totale di 50-100 embrioni). </li><li> Attraversare il pesce F0 che ha prodotto GFP / RFP progenie positivo di nuovo per ottenere un secondo lotto di positivi. </li></ol> 4.Proiezione del F1 Pesce. Il pesce F1 sono proiettati per stabilire famiglie F2, per documentare trappola genica pattern di espressione e di congelare partite di embrioni per l&#39;identificazione molecolare di trappola gene loci da 5 &#39;RACE e inversa PCR. <ol><li> Attraversare pesce F1 individuale con l&#39;UAS omozigote: MRFP pesce (Figura 4). </li><li> Il giorno seguente, posizionare il pesce F1 che ha dato embrioni in singoli serbatoi statici, mentre gli embrioni sono raccolti e proiettati. </li><li> Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf, 2 dpf e 3 dpf. Embrioni separati e fotografare positivi sia per la GFP e RFP 24. </li><li> A 5 dpf, congelare lotti di 20 GFP / RFP-positivi e 20 GFP / RFP embrioni-negativo per l&#39;identificazione di geni mutati da insertionally inversa PCR e 5 &#39;RACE 9,10. Sollevare rimanenti / embrioni RFP-GFP positive per stabilire generazione F2. </li></ol>

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Questi autori hanno nulla da rivelare.

I vettori trappola gene e la metodologia qui descritte sono già in uso in diversi laboratori indipendenti. Nella nostra esperienza, ci sono due fasi critiche del processo. Il primo passo fondamentale è quello di raggiungere elevati tassi di integrazione trappola gene in embrioni iniettati F0. Errore in questa fase può spesso essere attribuita alla contaminazione RNasi dei reagenti di iniezione, soprattutto al DNA miniprep. È inoltre molto importante per iniettare embrioni allo stadio 1 cellula per esperimenti trap gene. Nella nostra esperienza, la transgenesi mediata Tol2 è molto efficiente, che permette di ottenere linee transgeniche anche quando l&#39;iniezione successiva alla fase 1 cella o con il DNA di qualità inferiore. Iniezioni incagliati sono molto più problematico quando svolgimento trappola gene mutagenesi, dal momento che solo una piccola frazione delle integrazioni vettoriali comporta efficaci intercettare gli eventi del gene. Il secondo passo fondamentale è quello di accertare intercettare gli eventi del gene attraversando il nostro UAS: linea MRFP. Assenza di espressione MRFP èquasi sempre indicativo di un evento trappola enhancer. Tuttavia, talvolta la mancanza di espressione MRFP può indicare silenziamento dei 14x UAS. E &#39;quindi importante mantenere le UAS: linea MRFP in uno stato non silenziato propagando la prossima generazione utilizzando gli individui con alta espressione RFP quando incrociate di tpl6 NSF. Siamo in grado di prevedere facendo diversi miglioramenti per i nostri vettori intrappolare gene e il protocollo. Il primo è quello di utilizzare un UAS meno ripetitivo nel costrutto trappola gene. E &#39;stato dimostrato che un 5x UAS è sufficiente per raggiungere piena attivazione in esperimenti di coltura cellulare, e che le sequenze UAS meno ripetitive sono meno suscettibili di metilazione e silenziamento 6,25. Può anche essere possibile progettare vettori trappola gene per mutagenesi pienamente subordinata, in analogia con i vettori utilizzati dal mouse trappola gene consorzio internazionale e recentemente adattate zebrafish 2,26,27. Un altro miglioramento potrebbe essere quella di utilizzare un diverso tSistema ransposon, per esempio Sleeping Beauty 28, per generare un UAS: linea giornalista MRFP. Ciò consentirebbe iniezione di trappole gene basati Tol2 direttamente nella linea giornalista e lo screening di F0s da incrossing. Inoltre, verrebbe meno l&#39;utilizzo di due differenti background genetico, rendendo l&#39;interpretazione della perdita di fenotipi funzione più semplice. Anche con questi miglioramenti, il Gal4 protocollo trappola gene generale presentata qui sarebbe ancora pienamente applicabile.

Mutagenesi inserzionale ha dimostrato di essere un approccio efficace per dissezione funzione genica in diversi sistemi modello da organismi unicellulari come batteri e lieviti per gli organismi multicellulari come topi e piante. Qualsiasi DNA esogeno (virus, trasposone o plasmide) può servire come mutageno interrompendo elementi essenziali di geni come esoni o promotori. L&#39;obiettivo efficace di tali approcci semplici è estremamente piccolo in grandi genomi complessi, poiché esoni comprendono solo 1-3% di un tipico genoma vertebrato. Piccole efficace dimensione di destinazione può essere superato da tassi di integrazione molto elevato vettoriali, come esemplificato dal grande successo di retrovirale mutagenesi inserzionale in zebrafish 11,12. Al contrario, introni costituiscono circa il 20-30% dei genomi di vertebrati. In zebrafish, a base di trasposoni, vettori di mutagenesi inserzionale che introducono efficacemente gravi mutazioni hypomorphic su integrazione-null o in introni sono stati chiamati &quot;transposo gene di rotturans &quot;(GBTS) 8-10. Per un&#39;efficace integrazione trappola gene, usano un minimo Tol2 trasposone 13,14. Mutagenicità delle GBTS si basa su pesce di derivazione splice accettore e trascrizionali sequenze di terminazione / poliadenilazione. Gli elementi responsabili GBT mutagenicità si affiancano da siti loxP diretti di escissione da Cre ricombinasi. Così, l&#39;iniezione di mRNA Cre porta alla reversione efficiente delle mutazioni GBT-indotte, anche se alcune sequenze trasposoni rimangono al locus integrazione 9,10. I vettori GBT pubblicati recentemente usano MRFP come la trappola gene reporter 9,10, portando a due potenziali carenze. In primo luogo, non si sa quale frazione di geni di zebrafish sono espressi ad un livello abbastanza alto da essere rilevato da proteine ​​giornalista di fusione fluorescenti diretti. In secondo luogo, solo un piccolo sottoinsieme di geni, dovrebbe avere funzioni essenziali. E &#39;stato stimato che ci sono solo 1,400-2,400 geni necessari per svilupp zebrafishnt 15,16. La maggior parte dei mutanti trappola gene non sono tenuti a visualizzare fenotipi evidenti e quindi avrà un&#39;utilità limitata. Per superare queste due limitazioni, abbiamo modificato GBT-R15 9,10 da utilizzare con Gal4-VP16 come giornalista trappola gene primario (Balciuniene et al. In preparazione). Come con AUG-meno MRFP in GBT-R15, il sito di inizio della traduzione è stato rimosso dalla Gal4-VP16. Per il rilevamento diretto di eventi trappola gene, i nostri vettori contengono un reporter eGFP sotto il controllo di 14x Gal4 UAS 17,18. Diverse caratteristiche aggiuntive sono state progettate nel nostro bipartito trappola gene vettore. Le scuole universitarie professionali: cassette eGFP è affiancato da un sito scalo FRT (chevrons grigio nella Figura 1). Iniezione di Flp ricombinasi mRNA porta ad escissione delle UAS: cassette eGFP, lasciando la mutazione del gene trappola smarcato da eGFP fluorescenza. Può quindi essere utilizzato in linee transgeniche che segnano specifici tessuti o eventi sviluppo di fluorescenza GFP. Come in altreGBTS, l&#39;intera cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti loxP scalo (pentagoni aperti in Figura 1). Questo rende intercettare eventi gene reversibile mediante espressione di Cre ricombinasi, prontamente accertamento della prova di rapporto di causalità tra una determinata integrazione trappola gene e fenotipo osservato (Figura 2). Infine, la cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti invertiti meganuclease I-SCEI (triangoli neri in Figura 1). In Drosophila, integrazioni trasposoni sono spesso convertiti in delezioni (carenze) per escissione impreciso dell&#39;elemento P. Non ci sono prove che l&#39;escissione del trasposone Tol2 (o qualsiasi altro trasposone attivo nei vertebrati come la Bella Addormentata, PiggyBac o Ac / Ds) può portare ad eliminazioni. Abbiamo quindi incluso siti I-SCEI come un potenziale metodo surrogato per l&#39;induzione di delezioni, anche se non vi è alcuna prova che I-SCEI può indurre delezioni in zebrafish. Va notato che, mentre I-SCEI meganucleasi può essere utilizzato per facilitare transgenesi in zebrafish, taglio del DNA da I-SCEI meganuclease è utilizzata per studiare i meccanismi di riparazione del DNA, tra cui soggetto a errori non omologhe fine giunzione, nel lievito e cellule di mammifero 19-22. Integrazione della nostra trappola gene vettore può portare ad espressione eGFP da due meccanismi differenti. Il primo è un vero e proprio evento trap gene (Figura 1C): il vettore integra in un gene (IMG per Insertionally gene mutato), una trascrizione fusione tra il 5 &#39;del trascritto IMG endogeno e la Gal4-VP16 è realizzato e tradotto in un proteina di fusione contenente l&#39;N-terminale della proteina codificata da IMG e GAL4-VP16. Questa proteina di fusione lega ai 14x UAS e attiva la trascrizione di eGFP. Il secondo evento, meno desiderabile è una trappola enhancer (Figura 1D): il promotore minimo davanti eGFP cade sotto il controllo di un enhancer vicino al sito di integrazione, che porta alla produzione di eGFP in abindicationi della produzione Gal4-VP16. Nella nostra stima, il 30-50% degli eventi di espressione eGFP sono dovuti ad una trappola enhancer e il 50-70% sono dovuti a una trappola gene 23 (Balciuniene et al. In preparazione). Per distinguere tra queste due classi di eventi, abbiamo fatto un 14xUAS: MRFP linea transgenica (Figura 1B), per comodità segnata da specifici lente γCry: (. Balciuniene et al, in preparazione) GFP. Intercettare eventi Gene vengono verificati da co-espressione di GFP e RFP (confrontare C e D in figura 2). Nel nostro schermo pilota, abbiamo recuperato più di 40 eventi intercettare gene dopo lo screening di 270 F0 pesce iniettato con una miscela di DNA trasposone e transposase mRNA. Due dei nostri integrazioni trappola gene si sono verificati nei geni precedentemente pubblicati con mutanti indotti chimicamente: NSF e FLR. I fenotipi della nostra mutanti inserzionali tpl6 NSF e flr tpl24 sono superficialmente indistinguibili dal fenotipos dei corrispondenti mutanti indotti chimicamente. Abbiamo anche notato che gli eventi trap gene appaiono polarizzate verso gli introni vicino all&#39;estremità 5 &#39;dei geni, aumentando così la probabilità di alleli nulli. Facciamo osservare un certo grado di UAS silenziamento (variegatura) in tutte le nostre linee di trappola genica, e alcuni loci sono nettamente più sensibili alla variegatura di altri. Noi non crediamo che UAS silenziamento è un problema significativo per la propagazione delle linee trappola gene, come siamo stati in grado di propagare con facilità tutte le nostre linee di trappola genica attraverso almeno cinque generazioni selezionando per l&#39;espressione GFP da sola.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Grandi dimensioni frizione e sviluppo esterno di embrioni otticamente trasparenti rendono zebrafish un eccezionale sistema modello vertebrato per la mutagenesi inserzionale in vivo con i giornalisti fluorescenti per contrassegnare espressione dei geni mutati. Diversi laboratori hanno costruito e collaudato vettori-enhancer e gene-trap in zebrafish, utilizzando proteine ​​fluorescenti, attivatori trascrizionali basati lexA Gal4 e come reporter 1-7. Questi vettori avevano due possibili inconvenienti: rigore non ottimale (ad esempio, mancanza di capacità di distinguere tra gli eventi-enhancer e gene-trap) e bassa di mutagenicità (es. integrazioni in geni raramente prodotte alleli nulli). Gene Ultime Transposon (GBTS) sono stati sviluppati per affrontare questi inconvenienti 8-10. Abbiamo modificato uno dei primi vettori GBT, GBT-R15, per l&#39;utilizzo con Gal4-VP16 come giornalista primario trappola genica e UAS aggiunto: eGFP come giornalista secondario per il rilevamento diretto di manifestazioni trappola gene. Lapplicazione di Gal4-VP16 come primario giornalista trappola genica offre due vantaggi principali. In primo luogo, essa aumenta la sensibilità per geni espressi a bassi livelli di espressione. In secondo luogo, consente ai ricercatori di utilizzare le linee trappola del gene come autisti GAL4 alla diretta espressione di altri transgeni nei tessuti molto particolari. Ciò è particolarmente pertinente per i geni con funzioni non essenziali o ridondanti, in cui l&#39;integrazione trappola gene non può portare a fenotipi evidenti. Lo svantaggio dell&#39;utilizzo GAL4-VP16 come primario giornalista trappola gene è che i geni che codificano per proteine ​​con sequenze segnale N-terminale non sono suscettibili di cattura, come le proteine ​​di fusione risultanti GAL4-VP16 è improbabile che siano in grado di entrare nel nucleo e attivano trascrizione. È importante sottolineare che l&#39;uso di GAL4-VP16 non preselezionare per proteine ​​nucleari: abbiamo recuperato mutazioni geniche intrappolare nei geni che codificano proteine ​​che funzionano nel nucleo, citoplasma e membrana plasmatica.

In una iniezione di successo, almeno il 80% degli embrioni iniettati con la trappola gene DNA / Tol2 transposase mix mRNA visualizzare un certo livello di fluorescenza GFP (Figura 3). Quando i brillanti embrioni GFP-positive (Figura 3C) sono selezionati per stabilire la piscina F0, circa uno su 10 proiettato pesce F0 sarà resa gene trap progenie. Tra il pesce F0 da cui gli eventi trappola genica sono recuperati, più trasmettere un singolo evento trappola gene oltre a diverse integrazioni trasposoni non esprimono. Tuttavia, abbiamo stabilito fino a quattro linee trappola gene da un singolo individuo F0. GFP / RFP pattern di espressione in linee trappola gene vanno da estremamente specifico tessuto (per esempio in bulbi olfattivi) ad alquanto onnipresente. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figura 1. Tegli GAL4 contenenti trappola gene bipartito vettore GBT-B1 e le sue applicazioni. A. I componenti del Gal4 contenente trappola gene vettore: Tol2 5 &#39;e Tol2 3&#39;, minimal Tol2 trasposone finisce 13, CSA, Carp β-actina splice accettore 8; ^ Gal4-VP16, agosto-meno Gal4-VP16; ZP ( A), zebrafish β-actina UTR e poli 3 &#39;(A) gli elementi da GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP e SV40 p (A) sono componenti di UAS: eGFP cassetta di espressione 17,18. La freccia indica l&#39;attivazione di UAS: eGFP da Gal4-VP16 prodotta dalla trappola gene B. Il 14XUAS:. MRFP transgene segnato da un γCry specifico obiettivo: cassette GFP. La freccia indica l&#39;attivazione di UAS: MRFP da Gal4-VP16 in trans caso trappola C. Gene.. Scatole blu sono esoni. Splicing è indicato dalla linea tratteggiata. Evento trap D. Enhancer. L&#39;integrazione del vettore in prossimità di un potenziatore (scatola marrone) può mettere il minimo promotore eGFP sotto il controllo di questo enhancer (freccia marrone). Ciò si tradurrebbe in una espressione tessuto-specifica di eGFP, ma dal momento che Gal4-VP16 non è fatto, espressione MRFP non verrebbe attivata. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figura 2. Inversione di eventi trappola genica utilizzando Cre ricombinasi. A, B. Schema di una trappola gene mutazione (A) e Cre-ritornato trappola gene allele (B). C, D. Co-espressione di GFP (C) e RFP (D) nel sistema nervoso del gene tpl6 nsf linea trappola. E, F. Iniezione di Cre RNA in embrioni NSF tpl6 porta alla perdita di GFP (E) e RFP (F) espressione. Si noti che non vi è alcuna riduzione di espressione GFP nella lente, come previsto. Figura 3. Embrioni iniettati con la trappola gene GBT-B1 (pDB783). . A. embrioni iniettati con pGBT-B1 (pDB783) visualizzazione solo poco fluorescenza GFP nel corpo B, C. embrioni iniettati con pGBT-B1 e Tol2 transposase mRNA: un gruppo casuale di embrioni (B) e high-expressors selezionati per l&#39;allevamento (C). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figura 4. Schema sperimentale per la creazione di GAL4 linee trappola gene. Strutture rosso / verde in parte coincidenti indicano co-espressione di GFP e RFP, mentre il verde indica solo mosaicismo per intrappolare gene o trappola enhancer eventi.

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Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Questo protocollo descrive il metodo di trappola gene inserzionale mutagenesi utilizzando Gal4-VP16 come giornalista primario e GFP / RFP come reporter secondarie in zebrafish. Circa uno su dieci-alta esprimendo F0 gene rendimento pesce trappola progenie co-esprimono GFP e RFP. La procedura di screening può essere facilmente scalata per adattarsi alle dimensioni del laboratorio che esegue lo schermo mutagenesi inserzionale.

Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Views.  Temple University.  Questo protocollo descrive il metodo di trappola gene inserzionale mutagenesi utilizzando Gal4-VP16 come giornalista primario e GFP / RFP come reporter secondarie in zebrafish. Circa uno su dieci-alta esprimendo F0 gene rendimento pesce trappola progenie co-esprimono GFP e RFP. La procedura di screening può essere facilmente scalata per adattarsi alle dimensioni del laboratorio che esegue lo schermo mutagenesi inserzionale. 

Video: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Ricerca

Biologia

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induzione e test di ipossia in coltura cellulare

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish adulti

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...