Ringraziamo il Dott. Jennifer Emtage per la lettura critica del manoscritto, Ryan Gill per l&#39;assistenza tecnica e aiutare con cura zebrafish e il Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) per i reagenti. Il nostro lavoro è stato sostenuto da Temple University College di Scienza e Tecnologia e il National Institutes of Health (R01-HD061749).

1. La produzione del F0 Generation di microiniezione della Trappola Gene. Abbiamo scoperto che gli embrioni di diverse origini genetiche mostrano diverse tolleranze di questa procedura, con il tipo selvatico pet-store-based e Tuebingen - Long Fin (TLF) è la più tollerante mentre i ceppi AB e Tuebingen hanno più poveri la sopravvivenza. <ol><li> Preparazione del trasposone DNA. Preparare GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. In preparazione) DNA plasmidico utilizzando il kit QIAprep miniprep standard (Qiagen 27106). È essenziale includere la fase di lavaggio PB (che è opzionale in procedura QIAprep), altrimenti il DNA miniprep sarà contaminato da RNasi A, che porta alla degradazione dell&#39;mRNA transposase. Prima dell&#39;iniezione, diluire il DNA in acqua RNase-free (Ambion AM9937) a 10 ng / ml. </li><li> Preparazione di transposase mRNA. Linearizzare pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 utilizzando XbaI e trascrivere il DNA linearizzato utilizzando una macchina T3 mMessage(Ambion AM1348) nel kit di trascrizione in vitro. Abbiamo modificato la reazione di trascrizione in vitro con l&#39;aggiunta di 0,5 ml di inibitore RiboLock RNasi (ThermoFisher Fermentas EO0381). Dopo la fase di trattamento DNasi, purificare mRNA utilizzando un kit RNeasy MinElute (Qiagen 74.204). Valutare la qualità del mRNA in vitro trascritto mediante elettroforesi su gel di agarosio. Diluire il mRNA in acqua RNase-free a 40 ng / ml, e negozio come due aliquote microlitri a -80 ° C. </li><li> Preparazione della miscela microiniezione. Prima dell&#39;iniezione, aggiungere 8 ml di diluito DNA trasposone ad una aliquota 2 microlitri di transposase mRNA. </li><li> Microiniezione. Iniettare 3 nl di miscela di DNA / RNA nel tuorlo di 1 embrioni di zebrafish cella utilizzando tecniche standard di microiniezione, puntando per l&#39;interfaccia tuorlo / blastomeri. Raccogliere gli embrioni ogni 20 min per assicurare l&#39;iniezione in 1 fase delle cellule. Nella nostra esperienza, una persona abile può facilmente iniettare 1.000 embrioni in 1-1.5 ore. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, eseguire 5 ml di sinistraoltre soluzione iniettabile su un gel di agarosio 1% per il controllo di qualità, per garantire che l&#39;mRNA transposase non è degradata. </li><li> Cura embrione iniettato. Nel tardo pomeriggio, rimuovere gli embrioni non fecondate e anormali e distribuire gli embrioni di 60-80 per 100 millimetri piatto di Petri. Embrioni anormali e morte vengono rimosse al 1 ° giorno dopo la fecondazione (dpf), 2 dpf e 3 dpf. </li><li> Screening per l&#39;espressione GFP. Embrioni schermo senza difetti evidenti per GFP fluorescenza a 3 dpf (Figura 3). Lo screening può essere effettuato sia in uno stereomicroscopio dotato di fluorescenza (Nikon usiamo un SMZ1500) o su un microscopio verticale (usiamo un Zeiss AxioImager con un obiettivo 5X Fluar). Bassa espressione GFP indica o iniezione riuscita o degrado della trasposasi RNA a causa della contaminazione RNasi (Figura 3A). Selezionare circa il 30% degli embrioni brillanti che hanno o espressione GFP in diversi tessuti o in una elevata percentuale di cellule di un tessuto specifico (confrontare Figures 3B e 3C). Da una iniezione di 1.000 embrioni, di solito abbiamo fino a 100 evolutivamente-normale, alta-GFP che esprimono embrioni. </li><li> Sollevare embrioni F0 selezionati con procedure zebrafish allevamento standard. E &#39;ragionevole aspettarsi che il 20-30% degli embrioni iniettati selezionati per l&#39;allevamento potrà sopravvivere fino all&#39;età adulta. </li></ol> 2. Manutenzione degli UAS: MRFP Tester Line. Abbiamo generato una 14xUAS: linea MRFP segnata da γCry specifico obiettivo: GFP. Poiché UAS è soggetto a tacere attraverso la metilazione del DNA, è importante selezionare il pesce con bassi livelli di tacere per propagare il brodo. <ol><li> Impostare UAS individuale: omozigoti MRFP per l&#39;accoppiamento con una delle nostre linee più affidabili trappola gene GAL4, tpl6 NSF (Balciuniene et al in preparazione.). </li><li> Il giorno successivo, trasferire i UAS: pesce MRFP che hanno dato gli embrioni a singoli serbatoi statici, mentre gli embrioni sono raccoltie puliti. </li><li> Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf e 3 dpf. </li><li> Pesce intercross che ha dato embrioni con elevata espressione MRFP per stabilire la prossima generazione di UAS: linea MRFP. </li></ol> 3. Proiezione del F0 Pesce. <ol><li> Croce F0 individuale con il UAS omozigote: MRFP pesce (Figura 4). Noi di solito iniettiamo nostri GBTS in linee con wild-type o leopardo pigmentazione modelli, e le nostre UAS omozigoti: linea MRFP è in ottone background. Pertanto pesce F0 GBT-iniettato può essere facilmente distinguibili dalle UAS: MRFP pesce, eliminando la necessità di registrare se il F0 essere proiettato era un maschio o una femmina così come potenziali errori derivanti da errori di registrazione e / o determinare il sesso ogni pesce. Il personale con esperienza molto limitata, tali noi studenti universitari, sono quindi in grado di impostare e abbattere accoppiamenti di pesce. Questo approccio ha lo svantaggio che due diversi background genetici sonoin uso, potenzialmente complicando interpretazione di perdita di fenotipi funzionali. </li><li> Il giorno successivo, restituire le UAS in ottone: MRFP pesce per loro serbatoio. Mettere il pesce F0 che ha dato embrioni in singoli serbatoi statici (usiamo Hagen Exo Terra Faunarium Piccolo, ma ogni piccolo serbatoio può essere utilizzata per questo scopo), mentre gli embrioni sono raccolti e proiettati. </li><li> Pulire e trasferimento embrioni raccolti in nuove piastre di Petri (&lt;100 a piatto), nel pomeriggio del giorno 0. </li><li> Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf, 2 dpf e 3 dpf. Tirare embrioni positivi sia per GFP e RFP fuori, ordinarli per GFP / RFP pattern di espressione (se più di un modello si osserva in una frizione) e sollevare loro di stabilire generazione F1. </li><li> Euthanize il pesce F0 che produceva soltanto embrioni negativi (su un numero totale di 50-100 embrioni). </li><li> Attraversare il pesce F0 che ha prodotto GFP / RFP progenie positivo di nuovo per ottenere un secondo lotto di positivi. </li></ol> 4.Proiezione del F1 Pesce. Il pesce F1 sono proiettati per stabilire famiglie F2, per documentare trappola genica pattern di espressione e di congelare partite di embrioni per l&#39;identificazione molecolare di trappola gene loci da 5 &#39;RACE e inversa PCR. <ol><li> Attraversare pesce F1 individuale con l&#39;UAS omozigote: MRFP pesce (Figura 4). </li><li> Il giorno seguente, posizionare il pesce F1 che ha dato embrioni in singoli serbatoi statici, mentre gli embrioni sono raccolti e proiettati. </li><li> Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf, 2 dpf e 3 dpf. Embrioni separati e fotografare positivi sia per la GFP e RFP 24. </li><li> A 5 dpf, congelare lotti di 20 GFP / RFP-positivi e 20 GFP / RFP embrioni-negativo per l&#39;identificazione di geni mutati da insertionally inversa PCR e 5 &#39;RACE 9,10. Sollevare rimanenti / embrioni RFP-GFP positive per stabilire generazione F2. </li></ol>

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Questi autori hanno nulla da rivelare.

I vettori trappola gene e la metodologia qui descritte sono già in uso in diversi laboratori indipendenti. Nella nostra esperienza, ci sono due fasi critiche del processo. Il primo passo fondamentale è quello di raggiungere elevati tassi di integrazione trappola gene in embrioni iniettati F0. Errore in questa fase può spesso essere attribuita alla contaminazione RNasi dei reagenti di iniezione, soprattutto al DNA miniprep. È inoltre molto importante per iniettare embrioni allo stadio 1 cellula per esperimenti trap gene. Nella nostra esperienza, la transgenesi mediata Tol2 è molto efficiente, che permette di ottenere linee transgeniche anche quando l&#39;iniezione successiva alla fase 1 cella o con il DNA di qualità inferiore. Iniezioni incagliati sono molto più problematico quando svolgimento trappola gene mutagenesi, dal momento che solo una piccola frazione delle integrazioni vettoriali comporta efficaci intercettare gli eventi del gene. Il secondo passo fondamentale è quello di accertare intercettare gli eventi del gene attraversando il nostro UAS: linea MRFP. Assenza di espressione MRFP èquasi sempre indicativo di un evento trappola enhancer. Tuttavia, talvolta la mancanza di espressione MRFP può indicare silenziamento dei 14x UAS. E &#39;quindi importante mantenere le UAS: linea MRFP in uno stato non silenziato propagando la prossima generazione utilizzando gli individui con alta espressione RFP quando incrociate di tpl6 NSF. Siamo in grado di prevedere facendo diversi miglioramenti per i nostri vettori intrappolare gene e il protocollo. Il primo è quello di utilizzare un UAS meno ripetitivo nel costrutto trappola gene. E &#39;stato dimostrato che un 5x UAS è sufficiente per raggiungere piena attivazione in esperimenti di coltura cellulare, e che le sequenze UAS meno ripetitive sono meno suscettibili di metilazione e silenziamento 6,25. Può anche essere possibile progettare vettori trappola gene per mutagenesi pienamente subordinata, in analogia con i vettori utilizzati dal mouse trappola gene consorzio internazionale e recentemente adattate zebrafish 2,26,27. Un altro miglioramento potrebbe essere quella di utilizzare un diverso tSistema ransposon, per esempio Sleeping Beauty 28, per generare un UAS: linea giornalista MRFP. Ciò consentirebbe iniezione di trappole gene basati Tol2 direttamente nella linea giornalista e lo screening di F0s da incrossing. Inoltre, verrebbe meno l&#39;utilizzo di due differenti background genetico, rendendo l&#39;interpretazione della perdita di fenotipi funzione più semplice. Anche con questi miglioramenti, il Gal4 protocollo trappola gene generale presentata qui sarebbe ancora pienamente applicabile.

Mutagenesi inserzionale ha dimostrato di essere un approccio efficace per dissezione funzione genica in diversi sistemi modello da organismi unicellulari come batteri e lieviti per gli organismi multicellulari come topi e piante. Qualsiasi DNA esogeno (virus, trasposone o plasmide) può servire come mutageno interrompendo elementi essenziali di geni come esoni o promotori. L&#39;obiettivo efficace di tali approcci semplici è estremamente piccolo in grandi genomi complessi, poiché esoni comprendono solo 1-3% di un tipico genoma vertebrato. Piccole efficace dimensione di destinazione può essere superato da tassi di integrazione molto elevato vettoriali, come esemplificato dal grande successo di retrovirale mutagenesi inserzionale in zebrafish 11,12. Al contrario, introni costituiscono circa il 20-30% dei genomi di vertebrati. In zebrafish, a base di trasposoni, vettori di mutagenesi inserzionale che introducono efficacemente gravi mutazioni hypomorphic su integrazione-null o in introni sono stati chiamati &quot;transposo gene di rotturans &quot;(GBTS) 8-10. Per un&#39;efficace integrazione trappola gene, usano un minimo Tol2 trasposone 13,14. Mutagenicità delle GBTS si basa su pesce di derivazione splice accettore e trascrizionali sequenze di terminazione / poliadenilazione. Gli elementi responsabili GBT mutagenicità si affiancano da siti loxP diretti di escissione da Cre ricombinasi. Così, l&#39;iniezione di mRNA Cre porta alla reversione efficiente delle mutazioni GBT-indotte, anche se alcune sequenze trasposoni rimangono al locus integrazione 9,10. I vettori GBT pubblicati recentemente usano MRFP come la trappola gene reporter 9,10, portando a due potenziali carenze. In primo luogo, non si sa quale frazione di geni di zebrafish sono espressi ad un livello abbastanza alto da essere rilevato da proteine ​​giornalista di fusione fluorescenti diretti. In secondo luogo, solo un piccolo sottoinsieme di geni, dovrebbe avere funzioni essenziali. E &#39;stato stimato che ci sono solo 1,400-2,400 geni necessari per svilupp zebrafishnt 15,16. La maggior parte dei mutanti trappola gene non sono tenuti a visualizzare fenotipi evidenti e quindi avrà un&#39;utilità limitata. Per superare queste due limitazioni, abbiamo modificato GBT-R15 9,10 da utilizzare con Gal4-VP16 come giornalista trappola gene primario (Balciuniene et al. In preparazione). Come con AUG-meno MRFP in GBT-R15, il sito di inizio della traduzione è stato rimosso dalla Gal4-VP16. Per il rilevamento diretto di eventi trappola gene, i nostri vettori contengono un reporter eGFP sotto il controllo di 14x Gal4 UAS 17,18. Diverse caratteristiche aggiuntive sono state progettate nel nostro bipartito trappola gene vettore. Le scuole universitarie professionali: cassette eGFP è affiancato da un sito scalo FRT (chevrons grigio nella Figura 1). Iniezione di Flp ricombinasi mRNA porta ad escissione delle UAS: cassette eGFP, lasciando la mutazione del gene trappola smarcato da eGFP fluorescenza. Può quindi essere utilizzato in linee transgeniche che segnano specifici tessuti o eventi sviluppo di fluorescenza GFP. Come in altreGBTS, l&#39;intera cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti loxP scalo (pentagoni aperti in Figura 1). Questo rende intercettare eventi gene reversibile mediante espressione di Cre ricombinasi, prontamente accertamento della prova di rapporto di causalità tra una determinata integrazione trappola gene e fenotipo osservato (Figura 2). Infine, la cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti invertiti meganuclease I-SCEI (triangoli neri in Figura 1). In Drosophila, integrazioni trasposoni sono spesso convertiti in delezioni (carenze) per escissione impreciso dell&#39;elemento P. Non ci sono prove che l&#39;escissione del trasposone Tol2 (o qualsiasi altro trasposone attivo nei vertebrati come la Bella Addormentata, PiggyBac o Ac / Ds) può portare ad eliminazioni. Abbiamo quindi incluso siti I-SCEI come un potenziale metodo surrogato per l&#39;induzione di delezioni, anche se non vi è alcuna prova che I-SCEI può indurre delezioni in zebrafish. Va notato che, mentre I-SCEI meganucleasi può essere utilizzato per facilitare transgenesi in zebrafish, taglio del DNA da I-SCEI meganuclease è utilizzata per studiare i meccanismi di riparazione del DNA, tra cui soggetto a errori non omologhe fine giunzione, nel lievito e cellule di mammifero 19-22. Integrazione della nostra trappola gene vettore può portare ad espressione eGFP da due meccanismi differenti. Il primo è un vero e proprio evento trap gene (Figura 1C): il vettore integra in un gene (IMG per Insertionally gene mutato), una trascrizione fusione tra il 5 &#39;del trascritto IMG endogeno e la Gal4-VP16 è realizzato e tradotto in un proteina di fusione contenente l&#39;N-terminale della proteina codificata da IMG e GAL4-VP16. Questa proteina di fusione lega ai 14x UAS e attiva la trascrizione di eGFP. Il secondo evento, meno desiderabile è una trappola enhancer (Figura 1D): il promotore minimo davanti eGFP cade sotto il controllo di un enhancer vicino al sito di integrazione, che porta alla produzione di eGFP in abindicationi della produzione Gal4-VP16. Nella nostra stima, il 30-50% degli eventi di espressione eGFP sono dovuti ad una trappola enhancer e il 50-70% sono dovuti a una trappola gene 23 (Balciuniene et al. In preparazione). Per distinguere tra queste due classi di eventi, abbiamo fatto un 14xUAS: MRFP linea transgenica (Figura 1B), per comodità segnata da specifici lente γCry: (. Balciuniene et al, in preparazione) GFP. Intercettare eventi Gene vengono verificati da co-espressione di GFP e RFP (confrontare C e D in figura 2). Nel nostro schermo pilota, abbiamo recuperato più di 40 eventi intercettare gene dopo lo screening di 270 F0 pesce iniettato con una miscela di DNA trasposone e transposase mRNA. Due dei nostri integrazioni trappola gene si sono verificati nei geni precedentemente pubblicati con mutanti indotti chimicamente: NSF e FLR. I fenotipi della nostra mutanti inserzionali tpl6 NSF e flr tpl24 sono superficialmente indistinguibili dal fenotipos dei corrispondenti mutanti indotti chimicamente. Abbiamo anche notato che gli eventi trap gene appaiono polarizzate verso gli introni vicino all&#39;estremità 5 &#39;dei geni, aumentando così la probabilità di alleli nulli. Facciamo osservare un certo grado di UAS silenziamento (variegatura) in tutte le nostre linee di trappola genica, e alcuni loci sono nettamente più sensibili alla variegatura di altri. Noi non crediamo che UAS silenziamento è un problema significativo per la propagazione delle linee trappola gene, come siamo stati in grado di propagare con facilità tutte le nostre linee di trappola genica attraverso almeno cinque generazioni selezionando per l&#39;espressione GFP da sola.

<table><tbody><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Optional PB wash step is a must</td></tr><tr><td>XbaI restriction enzyme</td><td>ThermoFisher</td><td>ER0681</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Machine T3</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl!</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Has to be non-DEPC treated</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcapiliaries for calibration</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller *</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope for microinjection * </td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand</td></tr><tr><td>Picoinjector *</td><td>Harvard Instruments</td><td>Pli-90</td><td>We also use Pli-100</td></tr><tr><td>Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager</td><td>5X Fluar objective has sufficient working distance</td></tr><tr><td>Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td></tr></tbody></table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Grandi dimensioni frizione e sviluppo esterno di embrioni otticamente trasparenti rendono zebrafish un eccezionale sistema modello vertebrato per la mutagenesi inserzionale in vivo con i giornalisti fluorescenti per contrassegnare espressione dei geni mutati. Diversi laboratori hanno costruito e collaudato vettori-enhancer e gene-trap in zebrafish, utilizzando proteine ​​fluorescenti, attivatori trascrizionali basati lexA Gal4 e come reporter 1-7. Questi vettori avevano due possibili inconvenienti: rigore non ottimale (ad esempio, mancanza di capacità di distinguere tra gli eventi-enhancer e gene-trap) e bassa di mutagenicità (es. integrazioni in geni raramente prodotte alleli nulli). Gene Ultime Transposon (GBTS) sono stati sviluppati per affrontare questi inconvenienti 8-10. Abbiamo modificato uno dei primi vettori GBT, GBT-R15, per l&#39;utilizzo con Gal4-VP16 come giornalista primario trappola genica e UAS aggiunto: eGFP come giornalista secondario per il rilevamento diretto di manifestazioni trappola gene. Lapplicazione di Gal4-VP16 come primario giornalista trappola genica offre due vantaggi principali. In primo luogo, essa aumenta la sensibilità per geni espressi a bassi livelli di espressione. In secondo luogo, consente ai ricercatori di utilizzare le linee trappola del gene come autisti GAL4 alla diretta espressione di altri transgeni nei tessuti molto particolari. Ciò è particolarmente pertinente per i geni con funzioni non essenziali o ridondanti, in cui l&#39;integrazione trappola gene non può portare a fenotipi evidenti. Lo svantaggio dell&#39;utilizzo GAL4-VP16 come primario giornalista trappola gene è che i geni che codificano per proteine ​​con sequenze segnale N-terminale non sono suscettibili di cattura, come le proteine ​​di fusione risultanti GAL4-VP16 è improbabile che siano in grado di entrare nel nucleo e attivano trascrizione. È importante sottolineare che l&#39;uso di GAL4-VP16 non preselezionare per proteine ​​nucleari: abbiamo recuperato mutazioni geniche intrappolare nei geni che codificano proteine ​​che funzionano nel nucleo, citoplasma e membrana plasmatica.

In una iniezione di successo, almeno il 80% degli embrioni iniettati con la trappola gene DNA / Tol2 transposase mix mRNA visualizzare un certo livello di fluorescenza GFP (Figura 3). Quando i brillanti embrioni GFP-positive (Figura 3C) sono selezionati per stabilire la piscina F0, circa uno su 10 proiettato pesce F0 sarà resa gene trap progenie. Tra il pesce F0 da cui gli eventi trappola genica sono recuperati, più trasmettere un singolo evento trappola gene oltre a diverse integrazioni trasposoni non esprimono. Tuttavia, abbiamo stabilito fino a quattro linee trappola gene da un singolo individuo F0. GFP / RFP pattern di espressione in linee trappola gene vanno da estremamente specifico tessuto (per esempio in bulbi olfattivi) ad alquanto onnipresente. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figura 1. Tegli GAL4 contenenti trappola gene bipartito vettore GBT-B1 e le sue applicazioni. A. I componenti del Gal4 contenente trappola gene vettore: Tol2 5 &#39;e Tol2 3&#39;, minimal Tol2 trasposone finisce 13, CSA, Carp β-actina splice accettore 8; ^ Gal4-VP16, agosto-meno Gal4-VP16; ZP ( A), zebrafish β-actina UTR e poli 3 &#39;(A) gli elementi da GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP e SV40 p (A) sono componenti di UAS: eGFP cassetta di espressione 17,18. La freccia indica l&#39;attivazione di UAS: eGFP da Gal4-VP16 prodotta dalla trappola gene B. Il 14XUAS:. MRFP transgene segnato da un γCry specifico obiettivo: cassette GFP. La freccia indica l&#39;attivazione di UAS: MRFP da Gal4-VP16 in trans caso trappola C. Gene.. Scatole blu sono esoni. Splicing è indicato dalla linea tratteggiata. Evento trap D. Enhancer. L&#39;integrazione del vettore in prossimità di un potenziatore (scatola marrone) può mettere il minimo promotore eGFP sotto il controllo di questo enhancer (freccia marrone). Ciò si tradurrebbe in una espressione tessuto-specifica di eGFP, ma dal momento che Gal4-VP16 non è fatto, espressione MRFP non verrebbe attivata. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figura 2. Inversione di eventi trappola genica utilizzando Cre ricombinasi. A, B. Schema di una trappola gene mutazione (A) e Cre-ritornato trappola gene allele (B). C, D. Co-espressione di GFP (C) e RFP (D) nel sistema nervoso del gene tpl6 nsf linea trappola. E, F. Iniezione di Cre RNA in embrioni NSF tpl6 porta alla perdita di GFP (E) e RFP (F) espressione. Si noti che non vi è alcuna riduzione di espressione GFP nella lente, come previsto. Figura 3. Embrioni iniettati con la trappola gene GBT-B1 (pDB783). . A. embrioni iniettati con pGBT-B1 (pDB783) visualizzazione solo poco fluorescenza GFP nel corpo B, C. embrioni iniettati con pGBT-B1 e Tol2 transposase mRNA: un gruppo casuale di embrioni (B) e high-expressors selezionati per l&#39;allevamento (C). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figura 4. Schema sperimentale per la creazione di GAL4 linee trappola gene. Strutture rosso / verde in parte coincidenti indicano co-espressione di GFP e RFP, mentre il verde indica solo mosaicismo per intrappolare gene o trappola enhancer eventi.

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Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Questo protocollo descrive il metodo di trappola gene inserzionale mutagenesi utilizzando Gal4-VP16 come giornalista primario e GFP / RFP come reporter secondarie in zebrafish. Circa uno su dieci-alta esprimendo F0 gene rendimento pesce trappola progenie co-esprimono GFP e RFP. La procedura di screening può essere facilmente scalata per adattarsi alle dimensioni del laboratorio che esegue lo schermo mutagenesi inserzionale.

Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Temple University.  Questo protocollo descrive il metodo di trappola gene inserzionale mutagenesi utilizzando Gal4-VP16 come giornalista primario e GFP / RFP come reporter secondarie in zebrafish. Circa uno su dieci-alta esprimendo F0 gene rendimento pesce trappola progenie co-esprimono GFP e RFP. La procedura di screening può essere facilmente scalata per adattarsi alle dimensioni del laboratorio che esegue lo schermo mutagenesi inserzionale. 

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genetica

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Neuroscienze

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura fluorescente delle proteine nelle larve di zebrafish utilizzando CRISPR/Cas9 Knock-In

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish

Riepilogo

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Capitoli in questo video

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Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra