Questo studio è stato parte della Agricoltura e Agri-Food Canada A-Base progetto &quot;Sviluppo di tecniche high-throughput per i campioni di carne per ridurre il divario fenomenico per i tratti di qualità multivariati in selezione assistita da marcatori&quot;. L&#39;assistenza qualificata dell&#39;Unità carne bovina e il personale di elaborazione presso il Centro di Ricerca Lacombe sono sinceramente apprezzato. Gli autori desiderano ringraziare anche l&#39;assistenza tecnica dedicata di Christine Burbidge-Boyd, Fran Costello, Glynnis Croken e Rhona Thacker.

1. Collezione Steak <ol><li> Seguente classificazione a 24 ore - 48 ore dopo la macellazione, il muscolo longissimus (sia la fine del torace e / o dei lombi) viene rimosso da carcasse bovine e raccolto per l&#39;analisi della qualità. </li><li> Il muscolo è assettato di grasso sottocutaneo e squadrata. Il muscolo viene poi tagliato a 2,5 cm (1 in) bistecche seguendo protocolli di manipolazione degli alimenti e la sicurezza. Dopo il taglio dei singoli bistecche, le etichette appropriate (numero di animali, lato, la posizione muscolare, o il tempo) sono posizionati sulla rispettiva bistecca. </li><li> Bistecche vengono poi preparati per la conservazione. Se si vuole rimanere freschi, essi sono posti su un vassoio e portati alla griglia. Se le bistecche fresche non possono essere cotti immediatamente, hanno bisogno di essere coperto di plastica fino a quando la cottura può iniziare, per prevenire la disidratazione. Se bistecche devono essere invecchiato in un dispositivo di raffreddamento, o congelati, il peso viene registrato con due cifre decimali prima di essere immessi in un ossigeno impermeabile sottovuoto pacchetto bag e sigillato utilizzando una confezionatrice sottovuoto. Bistecche vengono poi poste nelle loro rispettive posizioni di archiviazione a lungo termine. </li></ol> 2. Procedura di cottura <ol><li> Se il campione è stato congelato, togliere dal freezer e mettere in un 4 ° C più fresco per scongelare durante la notte. </li><li> Il giorno della cottura, pre-riscaldare una griglia focolare aperto a 210 ° C per il campione di cottura, e preparare il sistema logger di temperatura e il computer inserendo le termocoppie nei punti vendita del dispositivo di scansione. Ingrassare leggermente la griglia con verdura accorciando di circa 10 min prima di iniziare la cottura. </li><li> Prima di iniziare a cucinare, togliere le bistecche dal radiatore. Togliere il campione dalla confezione e asciugare l&#39;umidità in eccesso dalla bistecca con un tovagliolo di carta. Registrare il peso grezzo della bistecca con due cifre decimali. </li><li> Inserire una termocoppia nel punto medio della bistecca lungo il suo asse longitudinale. Avviare la scansione termocoppia per registrare i dati di cottura. </li><li> Posizionare ilbistecche alla griglia, mantenendo il parallelo termocoppia alla superficie di cottura piana della bistecca e la griglia. Se la sonda non viene mantenuta parallela, può risultare in letture di temperatura impropri. </li><li> Cuocere le bistecche a una temperatura interna di 35,5 ° C, quindi capovolgere il campione più e continuare la cottura a una temperatura interna finale di 71 ° C. Una volta che la temperatura interna è di 71 ° C, togliere il campione dalla griglia e tirare la termocoppia fuori della bistecca. </li><li> Se un peso di cottura è desiderato, consentire la bistecca raffreddare leggermente (1-2 minuti), poi cancella il campione con un tovagliolo di carta per rimuovere l&#39;eccesso di umidità e di peso del campione a due cifre decimali. </li><li> Se sono necessari dati di cottura, salvare i dati di scansione termocoppia. </li></ol> 3. Angolo di regolazione e preparazione dei campioni <ol><li> Mentre il campione è ancora calda dal grill, fare un taglio 1-2 cm dall&#39;estremità laterale della bistecca per creare una estremità quadrata. </li><li> Una sezione 5 centimetri in tutto il widesimo del bistecca viene preparato utilizzando un &#39;campione scatola sizing&#39; con una tacca coltello a 5 cm, parallela al taglio originale. </li><li> L&#39;orientamento dell&#39;angolo fibra muscolare può essere misurata ponendo un goniometro sulla superficie coltello taglio della bistecca. </li><li> La scatola di taglio angolo variabile viene quindi impostata l&#39;angolo corrispondente del campione facendo scorrere la piastra metallica inferiore personalizzato con i fori inferiori di guida del coltello a doppia lama. Serrare le manopole per fissare la piastra metallica inferiore presso l&#39;angolo corrispondente. </li><li> Posizionare la sezione 5 cm, le bistecche nell&#39;area di taglio della scatola di taglio angolo variabile in modo che la direzione delle fibre muscolari è parallela l&#39;angolo del coltello a doppia lama. </li><li> Il coltello a doppia lama è utilizzata per tagliare una fetta 1 cm attraverso l&#39;precedentemente tagliato cinque centimetri pezzo, in modo assicurare che il coltello passerà attraverso l&#39;intero campione con l&#39;angolo corrispondente. Quando si posiziona la bistecca, assicurarsi che sia a contatto con il bordo della zona di taglio più vicino alutente, come il moto di taglio tirerà la bistecca verso l&#39;utente. </li><li> Per tagliare, inserire il coltello a doppia lama in area di taglio ed estrarre il coltello per tagliare la carne in una striscia di 1 cm. Per evitare lo strappo della carne, utilizzare un leggero movimento di taglio tirando la lama verso l&#39;utente. Mantenere le lame di coltello contro un bordo della piastra di guida per mantenere proporzioni uguali di taglio. </li><li> Il risultato dovrebbe essere un ambiente caldo, 1 cm di spessore fetta che è 5 cm di lunghezza, con le fibre sempre parallela alla fetta. Questa fetta viene poi utilizzato per fetta taglio analisi vigore della texture in carne. </li></ol> 4. Analisi forza di taglio <ol><li> Per determinare l&#39;analisi forza di taglio, la fetta al taglio protocollo vigente (SSF) utilizza i 1 centimetro di 5 cm affettare ottenuti con la scatola di taglio ad angolo variabile. Utilizzando una macchina analizzatore di struttura con una lama di taglio fetta piatta, l&#39;analisi è effettuata sulla fetta caldo. </li><li> Preparare l&#39;analizzatore di struttura con un kg di cellulare e insieme carico di 50la distanza di taglio a 48 mm, con una velocità di testa a croce di 500 mm / min. </li><li> Il taglio viene eseguita una volta, perpendicolare alle fibre muscolari di fornire un&#39;analisi accurata della forza massima richiesta per tranciare le fibre nella fetta. </li><li> Una volta che la fetta è stato tosato completamente attraverso il centro, salvare e registrare i dati. </li></ol>

<ol>
	<li>Jayasooriya, S. D., Torley, P. J., D'Arcy, B. R., Bhandari, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high+power+ultrasound+and+ageing+on+the+physical+properties+of+bovine+Semitendinosus+and+Longissimus+muscles.">Effect of high power ultrasound and ageing on the physical properties of bovine Semitendinosus and Longissimus muscles.</a> Meat Science. 75, 628-639 (2007).</li><li>Koohmaraie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+proteinases+and+meat+aging.">Muscle proteinases and meat aging.</a> Meat Science. 36, 93-104 (1994).</li><li>Lepetit, J., Culioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+meat.">Mechanical properties of meat.</a> Meat Science. 36, 203-237 (1994).</li><li>Honikel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+methods+supported+by+OECD+and+their+use+in+Mediterranean+meat+products.">Reference methods supported by OECD and their use in Mediterranean meat products.</a> Food Chemistry. 59, 573-582 (1997).</li><li>Monin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+methods+for+predicting+quality+of+whole+meat.">Recent methods for predicting quality of whole meat.</a> Meat Science. 49, S231-S243 (1998).</li><li>Shackelford, S., Wheeler, T., Koohmaraie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+slice+shear+force+as+an+objective+method+of+assessing+beef+longissimus+tenderness.">Evaluation of slice shear force as an objective method of assessing beef longissimus tenderness.</a> Journal of Animal Science. 77, 2693-2699 (1999).</li><li>Ju&#225;rez, M., Hui, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beef+Texture+and+Juiciness.">Beef Texture and Juiciness.</a> Handbook of meat and meat processing. , 177-206 (2012).</li><li>Kerth, C. R., Montgomery, J. L., Lansdell, J. L., Ramsey, C. B., Miller, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+gradient+in+longissimus+steaks.">Shear gradient in longissimus steaks.</a> Journal of Animal Science. 80, 2390-2395 (2002).</li><li>Janz, J. A. M., Aalhus, J. L., Dugan, M. E. R., Price, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mapping+method+for+the+description+of+Warner-Bratzler+shear+force+gradients+in+beef+Longissimus+thoracis+et+lumborum+and+Semitendinosus.">A mapping method for the description of Warner-Bratzler shear force gradients in beef Longissimus thoracis et lumborum and Semitendinosus.</a> Meat Science. 72, 79-90 (2006).</li><li>Derington, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+of+slice+shear+force+and+Warner-Bratzler+shear+force+of+beef+strip+loin+steaks+as+related+to+the+tenderness+gradient+of+the+strip+loin.">Relationships of slice shear force and Warner-Bratzler shear force of beef strip loin steaks as related to the tenderness gradient of the strip loin.</a> Meat Science. 88, 203-208 (2011).</li><li>Shackelford, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+Shear+Force.">Slice Shear Force.</a> Beef Facts. , (2009).</li><li>Henrickson, R. L., Mjoseth, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenderness+variation+in+two+bovine+muscles.">Tenderness variation in two bovine muscles.</a> Journal of Animal Science. 23, 325-331 (1964).</li><li>Ju&#225;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+relative+contribution+of+ante-+and+post-mortem+factors+to+the+variability+in+beef+texture.">Quantifying the relative contribution of ante- and post-mortem factors to the variability in beef texture.</a> Animal. FirstView, 1-10 (2012).</li><li>Shanks, B. C., Wulf, D. M., Maddock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+note:+The+effect+of+freezing+on+Warner-Bratzler+shear+force+values+of+beef+longissimus+steaks+across+several+postmortem+aging+periods.">Technical note: The effect of freezing on Warner-Bratzler shear force values of beef longissimus steaks across several postmortem aging periods.</a> Journal of Animal Science. 80, 2122-2125 (2002).</li><li>Lawrence, T. E., King, D. A., Obuz, E., Yancey, E. J., Dikeman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electric+belt+grill,+forced-air+convection+oven,+and+electric+broiler+cookery+methods+for+beef+tenderness+research.">Evaluation of electric belt grill, forced-air convection oven, and electric broiler cookery methods for beef tenderness research.</a> Meat Science. 58, 239-246 (2001).</li><li>Aalhus, J., Ju&#225;rez, M., Aldai, N., Uttaro, B., Dugan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meat+preparation+and+eating+quality.">Meat preparation and eating quality.</a> , 1058-1063 (2009).</li><li>Sa&#241;udo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+slaughter+weight,+breed+type+and+ageing+time+on+beef+meat+quality+using+two+different+texture+devices.">The effects of slaughter weight, breed type and ageing time on beef meat quality using two different texture devices.</a> Meat Science. 66, 925-932 (2004).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

La casella di angolo regolabile assicura la lama SSF cesoie sempre fibre muscolari in un vero angolo perpendicolare, piuttosto che approssimativamente perpendicolare che potrebbe accadere con un fisso taglio angolo di 45 ° 8. L&#39;applicazione della scatola di taglio angolo variabile permette di rappresentazioni più accurate della forza massima di taglio in un campione, ed è su questa base di migliorare le tecniche di analisi di qualità oggettive che la casella di taglio angolo variabile è stato svilupp...

La tenerezza è uno dei più importanti attributi di qualità a base di carne 1. Incoerenza nella tenerezza delle carni bovine è stato identificato come uno dei principali problemi che affliggono il settore della carne bovina 2. La forza di taglio (WBSF) prova Warner-Bratzler, caratterizzato da un foro in una piastra triangolare shear lavorato con precisione, è il metodo più diffuso per indicare carne tenerezza sensoriale 3,4, in quanto è il metodo strumentale che probabilmente ha mostrato la migliore correlazione con i punteggi panel sensoriali per la durezza di carne 5. Tuttavia, la fetta taglio protocollo forza (SSF) è diventata una tecnica importante per analizzare tessitura muscolare e tenerezza 6, in alternativa al protocollo standard di WBSF 7. E &#39;utile in casi in cui l&#39;analisi rapida o un elevato numero di campioni devono essere elaborati. Per la SSF, un solo core è preso dalla bistecca quando è ancora caldo, contro i core multipli (3-6) presa dalla bistecca di solito a poppaer 24 ore di refrigerazione per la WBSF 6. Da questa fetta, il SSF analizza la consistenza medio dell&#39;insieme bistecca 8, come è stato trovato che la tenerezza varia tra i lati mediale laterali della bistecca 9, con il centro e centro di bistecche aventi la migliore rappresentazione di media WBSF . La caduta della SSF è che, all&#39;interno di una bistecca, dal lato mediale a laterale, vi è variazione nei valori di forza di taglio 9, tuttavia, utilizzando sistematicamente la casella dimensionamento di fare 5 sezioni centimetri, si può ridurre la variabilità che potrebbe venire di utilizzare diverse sezioni della bistecca. Tuttavia, dal momento che alcune bistecche sono diverse dimensioni, una slice 5 cm può verificarsi in diverse posizioni la bistecca, che potrebbe poi influenzare i valori di forza di taglio 10. D&#39;altra parte, la scatola di taglio originale progettato avere la sezione da analizzare nel protocollo SSF permette solo 2 angoli fissi, 45 ° e 90 °, tuttavia, muscolocambia l&#39;orientamento della fibra all&#39;interno di bistecche, e all&#39;interno del muscolo 11. Shackelford e Wheeler 12, ha dichiarato che l&#39;angolo medio longissimus era 43,8 °, che era vicino a 45 ° ed è quindi ritenuto opportuno, quando i campioni sono stati prelevati sempre dalla stessa posizione. Tuttavia, Derington et al. 11 riportato un intervallo nel angolo delle fibre lungo il muscolo longissimus tra 33,1 ° e 53,9 °. Così, quando, per scopi di ricerca, diversi bistecche stesso animale devono essere analizzati, assegnando a tutti gli angoli di fibre sia 45 ° o 90 ° potenzialmente riduce la precisione. L&#39;utilizzo di una scatola di taglio angolo variabile può fornire una rappresentazione più accurata della forza di taglio massima, avente la capacità di misurare e regolare l&#39;angolo di taglio consente la fetta di eseguire costantemente parallelo con le fibre muscolari.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Packager</td>
			<td>Koch Equipment, Kansas City, MO, USA</td>
			<td>Model UV2100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Winpak Ltd., Winnipeg, MB, Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouples and Scanning Device</td>
			<td>Agilent / Hewlett Packard, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>34970A Data Acquisition Switch Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grill</td>
			<td>Garland Commercial Ranges Ltd., Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>Model ED-30-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crisco Vegetable Shortening</td>
			<td>The J.M. Smucker Company, Orrville, OH, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample sizing box</td>
			<td>G-R Manufacturing Co., Manhattan, KS, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angle adjustable box</td>
			<td>Innovation Centre, Red Deer College, Red Deer, AB, Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texture Analyzer Machine</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>Model TA-XT Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Load Cell, 50 kg</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>TA-XT Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USDA Warner-Bratzler knife w/guillotine block</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>TA-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat rectangle Blade for Slice Shear Force</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>TA-7C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing an angle adjustable cutting box for analyzing slice shear force in meat

Ricerca indica l&#39;angolo fibre del muscolo longissimus può variare, a seconda della posizione all&#39;interno di una bistecca e tutto il muscolo. Invece di utilizzare le originali fisse 45 ° o 90 ° angolo di taglio per testare forza di taglio, una scatola di taglio di angolo variabile può essere regolata in modo gli angoli dei coltelli corrispondono all&#39;angolo fibra di ciascun campione. Entro 2 minuti dopo la cottura ad una temperatura interna di 71 ° C su una griglia focolare aperto a 210 ° C, di 1 cm per 5 cm di base è tagliato dalla bistecca, parallelo alla direzione delle fibre muscolari, con 2 lame di coltello set 1 cm l&#39;uno dall&#39;altro. Questo nucleo calda viene poi sottoposto alla fetta Shear protocollo Force (SSF) valutare carne texture. L&#39;uso della scatola di taglio variabile angolo e il protocollo SSF fornisce una rappresentazione accurata della forza di taglio massima, come le fibre muscolari fetta e sono costantemente paralleli. Pertanto, la scatola di taglio ad angolo variabile, in combinazione con il protocollo SSF, può essere utilizzato come un high-esimotecnica roughput di valutare con precisione la tenerezza di carne in luoghi diversi del muscolo longissimus e, potenzialmente, in altri muscoli.

Trentuno finito commerciale manzi manzo sono stati macellati e le cui carcasse (528-601 kg) sono suddivise. Al fine di creare variabilità tenerezza, dritto stati immediatamente conservati a 2 ° C, mentre i lati sinistro sono stati tenuti a 10 ° C per 3 ore e poi a 2 ° C. I muscoli longissimus dal lato destro e sinistro sono stati rimossi 24 ore dopo la macellazione. I campioni provenienti dai lati destro (trattamento &quot;duro&quot;) sono stati analizzati, quel giorno, mentre i campioni dal lato sinistro (...

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Introducing an Angle Adjustable Cutting Box for Analyzing Slice Shear Force in Meat

Forza di taglio Slice è un metodo di riferimento per l&#39;analisi di consistenza delle carni bovine. Utilizzo di una casella di taglio regolabile angolo potrebbe aumentare la sua precisione per scopi di ricerca. I risultati di diverse posizioni all&#39;interno del<em&gt; Longissimus</em&gt; Muscolo mostrano una elevata correlazione con la Warner-Bratzler taglio metodologia di forza ed elevata adattabilità potenziale di muscoli diversi.

L&#39;introduzione di un angolo Box di taglio regolabile per Analizzando Slice forza di taglio a base di carne

Research indicates the fibre angle of the longissimus muscle can vary, depending upon location within a steak and throughout the muscle. Instead of using ...

introducing-an-angle-adjustable-cutting-box-for-analyzing-slice-shear

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  Agriculture and Agri-Food Canada. Forza di taglio Slice è un metodo di riferimento per l'analisi di consistenza delle carni bovine. Utilizzo di una casella di taglio regolabile angolo potrebbe aumentare la sua precisione per scopi di ricerca. I risultati di diverse posizioni all'interno del Longissimus Muscolo mostrano una elevata correlazione con la Warner-Bratzler taglio metodologia di forza ed elevata adattabilità potenziale di muscoli diversi.

Video: Introducing an Angle Adjustable Cutting Box for Analyzing Slice Shear Force in Meat

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Slice Cultura organotipica di E18 cervello dei topi

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Ricerca

Biologia

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

A cellula intera Recordings of Light Evocati eccitatorio Correnti Synaptic nel Slice Retinal

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Un metodo per la selezione di aptameri-struttura di commutazione Applicato ad una colorimetrico oro nanoparticelle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Progettazione e sviluppo di aptameri delle nanoparticelle d&#39;oro Based colorimetriche saggi per applicazioni in-the-field

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

L&#39;Assemblea e l&#39;applicazione di &quot;Shear Anelli &#39;: A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Rilevamento e caratterizzazione dell'autoassemblaggio proteico in vivo da parte della Cytometria di flusso

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Automated Charting of the Visual Space of Housefly Compound Eyes

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands of visual units called ommatidia. Each ommatidium samples the optical information from a small solid angle, with an approximate Gaussian-distributed sensitivity (half-width on the order of 1&#730;) centered around a visual axis. Together, the ommatidia gather the visual information from a nearly panoramic field of view. The spatial distribution of the visual axes thus determines the eye's spatial resolution. Knowledge of the optical organization of a compound eye and its visual acuity is crucial for quantitative studies of neural processing of the visual information. Here we present an automated procedure for mapping a compound eye's visual axes, using an intrinsic, in vivo optical phenomenon, the pseudopupil, and the pupil mechanism of the photoreceptor cells. We outline the optomechanical setup for scanning insect eyes and use experimental results obtained from a housefly, Musca domestica, to illustrate the steps in the measurement procedure.

The protocol here describes the measurement of the spatial organization of the visual axes of housefly eyes, mapped by an automatic device, using the pseudopupil phenomenon and the pupil mechanism of the photoreceptor cells.

Creazione automatica di grafici dello spazio visivo degli occhi composti di Housefly

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Raccolta e mantenimento a lungo termine delle formiche tagliafoglie (Atta) in condizioni di laboratorio

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...