Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

Per iniziare, posiziona il mouse rasato e anestetizzato su un tappetino riscaldante. Pizzicare la pelle con una pinzetta vicino al quarto capezzolo e tagliare la pelle sollevata con forbici affilate per praticare un'incisione sulla linea mediana di circa un centimetro. Praticare incisioni circolari attorno alla ghiandola sia in direzione cranica che caudale e staccare con cura la pelle dall'addome.

Rimuovere prontamente il sangue esogeno con soluzione fisiologica per evitare la successiva perdita di risoluzione ottica. Per ridurre al minimo la perdita di sangue, sigillare tutti i vasi sanguigni prominenti con un cauterizzatore portatile. Quindi stuzzicare delicatamente lo strato superficiale con una pinza fine per rimuovere il tessuto connettivo e adiposo superficiale.

Mantenere umida la ghiandola esposta con soluzione fisiologica. Se necessario, trattare la ghiandola con agenti esogeni, ad esempio agenti farmacologici o coloranti specifici per organelli, bagnando le ghiandole esposte durante l'intervento chirurgico. Proteggere la parete addominale con un film termoplastico semitrasparente e flessibile.

Posizionare con cautela il mouse con il lato addominale rivolto verso il basso su un tavolino per microscopio invertito in modo che il lembo cutaneo si estenda sul vetro di copertura centrale. Proteggere le aree esposte con un sottile strato di gel. Fissare la gamba posteriore e la coda al palco.

Quindi posizionare un distanziatore dentato su misura preparato da tre bastoncini di cotone nastrati tra il lembo della pelle e la parete del corpo per attutire la ghiandola dagli artefatti di movimento causati dalla respirazione e dal battito cardiaco. Fissare saldamente una copertura di plastica su entrambe le estremità dell'apertura del tavolino per evitare che il lembo della pelle scivoli durante l'imaging. Inserire un catetere a permanenza sottocutanea sotto la pelle dorsale collegato a un tubo, una siringa e una pompa.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale, confermare che il lembo cutaneo sia stabile con un flusso sanguigno adeguato. Eseguire la microscopia confocale convenzionale del topo EGFP cito o membrana EGFP marcato con BODIPY 665676 e la microscopia a due fotoni del topo membrana EGFP marcato con monodansilpentano e tdTomato membrana di topo marcato con monodansilpentano. Nei topi citogenici EGFP, il citoplasma delle cellule epiteliali secretorie è stato marcato distintamente da EGFP.

Allo stesso tempo, le goccioline lipidiche colorate con BODIPY 665676 apparivano come corpi fluorescenti rotondi, specialmente verso la superficie apicale. L'analisi time-lapse ha mostrato che BODIPY 665676 goccioline lipidiche colorate che si spostano dalle regioni basali a quelle apicali a velocità variabili e si fondono tra loro durante il trasporto. Nei topi di membrana EGFP, EGFP ha evidenziato le membrane plasmatiche delle cellule epiteliali capillari e secretorie e le goccioline lipidiche colorate con BODIPY erano visibili in tutto il citoplasma.

Due microscopie fotoniche delle ghiandole mammarie di topi con membrana EGFP o con membrana tdTomato hanno permesso un'indagine più completa della morfologia delle ghiandole. Le fibre di collagene sulla superficie vengono visualizzate nel canale del monodansilpentano attraverso la generazione della seconda armonica. Più all'interno del parenchima, l'epitelio secretorio si rivela con membrane plasmatiche basali, laterali e apicali e goccioline lipidiche colorate con monodansilpentano.

Il lume centrale diventa evidente più all'interno dell'alveolo. Il fluoroforo rosso tdTomato è stato particolarmente utile per marcare l'endotelio capillare, a differenza dell'EGFP nei topi cito EGFP.