Name: culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification
Uploaded: 2016-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
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We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF &amp; VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti in conformità con gli animali del Regno Unito (Procedure Scientifiche) Act del 1986 e gli animali sono stati mantenuti in accordo con il Ministero dell&#39;Interno pubblicato Codice di condotta per l&#39;alloggiamento e la cura degli animali allevati, Fornito o utilizzati a fini scientifici. NOTA: Gli esperimenti effettuati utilizzando wild-type C57Bl / 6J topi sono ben stabiliti e descritti di seguito. Metatarsi embrionali provenienti da diversi ceppi di topi possono allo stesso modo essere coltivate in vitro, anche se i loro tassi di crescita e di mineralizzazione possono essere diverse a quelle descritte nel presente documento. 1. dissezione Condizioni e preparazione degli strumenti <ol><li> Eseguire tutta la preparazione dei media, tessuti dissezioni e il lavoro della cultura in una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità dei media e rudimenti embrionali. </li><li> Consentire terreni di coltura e dissezione per equilibrare per almeno 1 ora a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore prima dell&#39;uso. </li><li> sterilizzare dissezioneforbici, Dumont # 5 e # 4 Dumont pinzette accanto a un paio di Superfine Vännäs micro forbici (8 cm rette, 3 mm lame) in autoclave. Dopo la sterilizzazione in autoclave, immergere l&#39;apparecchiatura dissezione in etanolo al 70% prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di dissezione e di cultura dei media <ol><li> Preparare mezzo di dissezione <ol><li> Diluire media Essential α-minimo (senza nucleosidi, αMEM) in tampone fosfato (PBS) (1,13) e risospendere albumina sierica bovina (BSA) a 2 mg / m l prima filtro sterilizzante attraverso una siringa diametro di 0,22 micron, 33 millimetri filtro. NOTA: media dissezione può essere fatta, filtro sterilizzato e conservato in aliquote a -20 ° C a tempo indeterminato. </li></ol></li><li> Preparare terreno di coltura <ol><li> Cultura metatarsi embrionali in 300 ml di terreno di coltura (in ciascun pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti). Preparare il terreno di coltura con l&#39;aggiunta di 0,2% w / v BSA; 5 ug / ml di L-ascofosfato acido di rbic; 1 mM β-glicerofosfato (βGP; opzionale - vedi sezione risultati); 0,05 mg / ml di gentamicina e 1,25 mg amfotericina B a αMEM e filtro sterilizzare attraverso un filtro di diametro siringa da 0,22 micron, 33 mm. </li></ol></li></ol> 3. murino embrionale metatarso Dissection e cultura <ol><li> Abbattere il mouse in stato di gravidanza, l&#39;ospitare 15 giorni di età embrioni, da dislocazione cervicale in conformità con le linee guida home office nel Regno Unito </li><li> Posizionare la supina animale e disinfettare la pelle a spruzzo con il 70% di etanolo. Utilizzando forbici dissezione fare una grande incisione sulla linea mediana, penetrando sia la pelle e il peritoneo per esporre la cavità addominale. </li><li> Individuare le due corna uterine dell&#39;animale nella regione dorsale della cavità del corpo. Rimuovere le corna uterine da un lato liberando ogni uterino dal mesometrio da attenti incisioni con le forbici dissezione e infine il taglio delle corna uterine libera alla loro base. Place corna uterine in media dissezione. </li><li> Separare ogni embrione, tagliando tra i siti di impianto lungo il corno uterino e rimuovere gli embrioni dalle loro singole sacche con pinze. embrioni da riforma per decapitazione, in conformità con le linee guida home office nel Regno Unito </li><li> Dopo la disinfezione della pelle a spruzzo con il 70% di etanolo, usare le forbici Vannas micro per rimuovere gli arti posteriori da embrioni incidendo intorno al femore prossimale. Questo assicura tanto degli arti posteriori possibile è rimosso. Posizionare gli arti posteriori in una capsula di Petri sommerso nel mezzo di dissezione prima metatarso dissezione. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, cominciare a rimuovere la pelle che circonda il piede embrionale, pizzicando e tirando fuori con il # 5 pinzette, mentre tenendo premuto il arto posteriore costante con il # 4 pinzette. Questo è più efficace eseguita afferrando la pelle a circa il livello della tibia e tirando verso le falangi. L&#39;uso di forbici in questa fase per tagliare ilpelle molto sottile non è necessaria. </li><li> tenere attentamente le tarso del piede embrionale con # 4 pinzette e rimuovere il primo e il quinto metatarso pizzicando fuori vicino alle tarso usando # 5 pinzette e scartare. </li><li> Con il piede tenuto nella stessa posizione, utilizzare il # 5 pinzette per distruggere il tessuto connettivo tra i tre falangi rimanenti e metatarsi. Inserire la punta di # 5 pinzette in corrispondenza del giunto tra le falangi e metatarsi per rimuovere le falangi dei metatarsi. </li><li> Infine, usare # 5 pinzette per distruggere il tessuto connettivo tra le tarso e metatarso. Anche in questo caso posizionare la punta del # 5 pinzette nello spazio articolare tra le tarso e metatarso e delicatamente liberi metatarsi dai tarso. </li><li> Delicatamente raccogliere i metatarsi ora liberi con # 4 pinzette e posto in media dissezione fresco. NOTA: la dissezione attenta dovrebbe fornire 6 metatarsi da ogni embrione. </li><li> Quando tutti i metatarsi richiesti sono stati sezionati, carefuLLY luogo metatarsi singolarmente nelle piastre da 24 pozzetti pre-riscaldato contenenti 300 ml di terreni di coltura. Metatarsi Culture a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per un massimo di 14 giorni. NOTA: Non modificare i mezzi di comunicazione di culture E15 fino ad almeno 5 giorni di cultura come questo influenza la loro capacità di mineralizzazione 26. Le ragioni di questo non sono chiari, ma la crescita lineare e matrice mineralizzazione possono dipendere stimolazione con fattori di crescita rilasciati dalle metatarsi. </li></ol> 4. analisi e la manipolazione delle Culture metatarso <ol><li> Il giorno della dissezione (giorno 0) eseguire misure longitudinali iniziali utilizzando un microscopio con un software videocamera collegata e analisi di immagine digitale. Misurare la lunghezza della zona centrale mineralizzazione quando appare dopo pochi giorni di coltura. </li><li> Periodicamente, come richiesto, effettuare ulteriori misurazioni (di solito ogni 2 ° giorno) fino all&#39;ultimo giorno della cultura a quel punto mossa etatarsal vengono elaborati dipende risultati richiesti (discusso in premessa). </li><li> Media Supplemento di culture metatarso d&#39;organo con vari fattori esogeni ad esempio fattori di crescita, ormoni e agenti farmacologici dal giorno 0 della cultura 22,24. In tutti gli studi di questo tipo, di controllo sono necessari metatarsi non trattati. NOTA: Anche se è consigliabile che le ossa di controllo sono il rudimento equivalenti dalla gamba controlaterale, non ce ne è stato eventuali differenze di crescita lineare o potenziale mineralizzazione delle colta E15 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso (vedi sotto, figura 2) . </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La cultura del metatarso embrionali murine fornisce un modello altamente fisiologico della crescita endochondral e mineralizzazione. I primi studi hanno confermato che E15 metatarsi del mouse subiscono un normale modello di crescita scheletrica e la differenziazione. La cartilagine (condrociti) e l&#39;osso (osteoblasti e osteoclasti), le cellule e le loro rispettive matrici di collagene sono indistinguibili da quelle osservate in vivo. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni riconosciute di questo modello. La velocità di differenziazione degli osteoclasti è compromessa così come la crescita delle ossa (ma non cartilagine differenziazione). La crescita ossea è circa il 50% inferiore a quella osservata in vivo e può essere causa di carenze in fattori sistemici che influenzano la produzione di fattori locali (ad esempio, IGF-1, BMP, ecc) 31. Inoltre, è ben noto che l&#39;osso è sensibile al suo ambiente meccanico e questo è anche il caso per metatarsi coltivate, che rispondono alla cHANGES a carico 32,33 meccanica. Pertanto, in situazioni non caricati, come descritto in questo protocollo, la mineralizzazione e il riassorbimento minerale potrebbe essere compromessa. Tuttavia, il modello metatarso offre la possibilità di misurare direttamente la crescita delle ossa lineare che non è possibile tramite 2D e 3D in sistemi di coltura in vitro. Abbiamo fornito una descrizione completa del protocollo coinvolti nella dissezione e la cultura della E15 metatarsi murini e in effetti, per la prima volta, confermare la validità di mettere in comune i 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso per gli esperimenti. Metatarsi da E17 / E18 sono comunemente usati per studiare i meccanismi di crescita ossea a causa della loro straordinario potenziale per crescere ex vivo per lunghi periodi di tempo (cioè oltre i 14 giorni di cultura). Si tratta di un modello consolidato per indagare il ruolo dei fattori di crescita sulla crescita embrionale ossea longitudinale.Inoltre, la dissezione e la cultura di metatarsi postnatali è comunemente impiegato per delineare i meccanismi che circondano la crescita delle ossa post-natale, come si è capito che la crescita delle ossa post-natale e la crescita delle ossa del feto sono regolati in modo diverso 21. La crescita ossea osservata in metatarsi postnatali in coltura è comunque notevolmente inferiore a quello osservato nei rudimenti embrionali 25,34, limitando il loro potenziale in studi a lungo termine e mettendo in evidenza l&#39;influenza più sistemico sulla crescita delle ossa, in questa fase post-natale. Infatti, 3 giorni di età metatarsi postnatale di topi sono tipicamente l&#39;ultima fase che può essere utilizzato per ottenere misurabile 34 crescita. Qui si descrive il nostro protocollo per l&#39;isolamento delle ossa del metatarso embrionali a E15. L&#39;assenza di minerale hydroxyapaptite in E15 metatarsale significa che essi forniscono un modello ineguagliabile per indagare non solo i meccanismi circostanti crescita ossea longitudinale, ma anche l&#39;iniziazionedi mineralizzazione scheletrica. La matrice mineralizzata della zona di condrociti ipertrofica terminale fornisce un&#39;impalcatura per invadere osteoblasti stabilire un osso specifica matrice (osteoide), che viene successivamente mineralizzata, e come tale questo mineralizzazione iniziale è di vitale importanza per la formazione delle ossa di successo e funzionale 35. In effetti una serie di rapporti recenti che utilizzano metatarsi E15 hanno confermato la loro capacità unica per l&#39;indagine del 28,36,37 processo di mineralizzazione. Inoltre, i ricercatori hanno descritto l&#39;uso di metatarsi E15 come modello di angiogenesi 38, mettendo in evidenza il potenziale di metatarsi embrionali come modello di fuori del contesto della crescita ossea / mineralizzazione. Il protocollo che descriviamo richiede solo apparecchiature di laboratorio standard tra cui una cappa flusso laminare, un microscopio da dissezione per eseguire la dissezione, e un incubatore di CO 2 per la cultura dei primi rudimenti escisse. Inoltre, una strada molto essenzialeture terreno contenente αMEM, BSA, antibiotici, antimicotici e l&#39;acido L-ascorbico (un cofattore nella sintesi di idrossiprolina e idrossilisina, due amminoacidi essenziali per la produzione di collagene 39) evita l&#39;uso di additivi non definiti, come siero animale . Tradizionalmente, gli investigatori hanno aggiunto βGP ai mezzi utilizzati per la coltura metatarsi embrionali, ma come rivelato nei nostri risultati, l&#39;uso di una fonte di fosfato supplementare non è richiesto per la mineralizzazione successo in questo sistema di coltura. Questo è un dato importante nella nostra ricerca di comprensione dei meccanismi alla base ECM mineralizzazione. Metatarsi sono stati precedentemente infettati con adenovirus contenenti forme dominanti negativi di Smad2 per esplorare il ruolo di fattore di crescita trasformante β nella regolazione dello sviluppo delle ossa lunghe 40. Qui si rivelano anche la trasfezione di successo di wild-type ossa metatarsali E15 con particelle virali GFP, indicando ttecniche di cappello lentivirali potrebbero essere facilmente adottate per manipolare l&#39;espressione genica nelle culture del metatarso. Analogamente, il sistema di coltura organo metatarso è un modello eccellente in cui confrontare la crescita delle ossa da topi geneticamente modificati per comprendere meglio il ruolo di un particolare gene nel processo di crescita ossea. I nostri studi precedenti hanno utilizzato il sistema di coltura di organi metatarso per determinare il ruolo di soppressore di citochine segnalazione-2 (SOCS2) in crescita ossea endochondral. Utilizzando ossa del metatarso da topi deficienti in SOCS2, abbiamo dimostrato che l&#39;ormone della crescita è in grado di simulare il loro longitudinale crescita autonoma di insulina come fattore di crescita (IGF-1), a differenza di wild-type ossa metatarsali che non rispondono alla crescita trattamento ormonale 34, 41. Ciò evidenzia la misura in cui le culture metatarsali possono essere manipolati per esaminare gli effetti di diversi geni e / o fattori esogeni sulla crescita ossea endochondral. In sintesi, abbiamo detaicondotto un metodo per l&#39;estrazione di successo e cultura metatarsale embrionali che possono essere manipolate ed esaminati utilizzando una varietà di analisi. Questo modello ex vivo mantiene cellula-cellula e le interazioni cellula-matrice, così come contiene condrociti in diverse fasi di condrogenesi, fornendo quindi un modello più fisiologico di cellule in monostrato o coltura 3D. Metatarsali organo culture sono quindi un modello unico per lo studio dei meccanismi molecolari responsabili encondrale, e sono essenziali per migliorare la nostra comprensione sia la fisiologia dell&#39;osso e fisiopatologia

Lo scheletro è un organo altamente complessa, dinamica e complessa che ha una gamma di funzioni che vanno dalla locomozione, per l&#39;omeostasi di ioni. Composto da ossa e cartilagine, lo scheletro è costituito da popolazioni di cellule funzionalmente distinte che operano per mantenere la propria integrità strutturale, biochimico e meccanica 1. Una delle funzioni primarie dello scheletro è il suo ruolo nello sviluppo e crescita. Questi processi richiedono l&#39;orchestrazione di molteplici popolazioni cellulari che sono regolati attraverso endocrino stretto e controllo genetico. Con l&#39;eccezione della ossa piatte es scapola, cranio e dello sterno, lo scheletro dei mammiferi è formata attraverso il processo noto come encondrale. Questo processo, regolato sia molecolarmente e spazialmente, inizia con la condensazione di cellule mesenchimali derivate principalmente dal mesoderma 2. Sotto l&#39;influenza del fattore di trascrizione SOX9, cellule in the all&#39;interno degli condensazioni differenziarsi in condrociti, esprimere e secernere componenti cartilagine specifiche matrice extracellulare (ECM) come collagene di tipo II e aggrecano. Le cellule al margine della condensazione, esprimono collagene di tipo I e formo la pericondrio, delineando la prospettiva osso 3. Più tardi, i osteoprogenitors del pericondrio differenziano in osteoblasti, diretto da l&#39;espressione dei fattori di trascrizione, Runx2 e Osterix 4. Questo porta ad una predominanza di osteoblasti e questo strato viene rinominato periostio che forma un collare osseo mineralizzato intorno alla metà sezione dell&#39;osso. La penetrazione vascolare del periostio e l&#39;invasione del ponteggio cartilaginea avviene portando con sé, haematopoetically derivato cellule ossee riassorbimento, osteoclasti, che riassorbono i resti di condrociti e gran parte della matrice cartilaginea 5. Gli spazi formati sono riempiti da osteoprogenitors all&#39;origine della ossificazione primariacentro che occupa progressivamente il nucleo della diafisi e si fonde con il periostio. Altre cellule danno origine al midollo osseo. Intorno nascita, vasi sanguigni e osteoprogenitors penetrano la matrice cartilaginea ricca su entrambi i lati (epifisi) della diafisi sviluppo per formare il centro di ossificazione secondario. Situato tra l&#39;epifisi e diafisi alle due estremità delle ossa lunghe sono un gruppo di cartilagine - la cartilagine di accrescimento epifisaria - che è responsabile del coordinamento crescita lineare di tutte le ossa lunghe 6. I condrociti all&#39;interno della cartilagine di accrescimento inizialmente proliferano e successivamente progressi attraverso le zone morfologicamente distinte, coordinati da espressione sequenziale di fattori di trascrizione e di crescita. Il culmine di questa sequenza di eventi è l&#39;uscita dal ciclo cellulare e l&#39;ipertrofia dei condrociti al centro di questa cartilagine precursore. condrociti ipertrofici esprimono fortemente tipo X collagene e metalloproteinasi della matrice-13 (MMP13) e la loro notevole allargamento volume nella direzione della crescita longitudinale fornisce il maggior contributo alla crescita delle ossa nei mammiferi 7,8. Inoltre, condrociti ipertrofici mineralizzano loro ECM circostante attraverso il rilascio di vescicole matrice, strutture a membrana delimitata specializzati per la produzione di fosfato di calcio amorfo attraverso la loro inclusione di fosfatasi (tessuto non specifico fosfatasi alcalina (TNAP) e PHOSPHO1) e di calcio canalizzazione proteine ​​(annexins ) 9-11. Questa cartilagine calcificata è invasa da vasi sanguigni dal midollo sottostante con conseguente reclutamento degli osteoclasti e matrice di riassorbimento. Questa è seguita da migrazione degli osteoblasti e l&#39;allineamento alla superficie dei resti cartilagine calcificata dove stabiliscono uno strato di osteoide che è rapidamente mineralizzato. Il tessuto osseo del spugnoso è poi ristrutturato per osso lamellare della spongiosa secondario 12. risultati di fusione epifisari nelcessazione di encondrale 13. Encondrale è sotto stretta regolamentazione da molti ormoni endocrini e paracrini e fattori di crescita, in modo da prevenire lo sviluppo disturbato e / o la crescita delle ossa longitudinale 14. Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari alla base di questi processi è quindi indispensabile nella nostra ricerca di progressi clinici verso beneficio umano. Precedenti ricerche sulle somiglianze e le differenze tra le cartilagini di accrescimento di differenti età, luoghi e specie hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione dei meccanismi fisiologici che circondano dinamiche cartilagine di accrescimento 15,16. Tuttavia, lo studio dei condrociti isolati è difficile, come la rimozione dei condrociti dal loro ambiente può portare a dedifferentiation, accompagnato da perdita di espressione di marcatori chiave come COL2A1 17. Il mouse metatarso espianto di organi, pioneered dal Prof. Elisabeth Burger ei suoi colleghi nei Paesi Bassi, è un ex vivo modello altamente fisiologico per lo studio encondrale e la crescita delle ossa, come il tasso di crescita delle ossa nella cultura imitano quello visto in vivo 18. Unicamente, la cultura organo metatarso consente l&#39;esame dei condrociti in diverse fasi di condrogenesi e mantiene cellula-cellula e cellula-matrice interazioni, fornendo quindi condizioni più prossime alla situazione in vivo di cellule in coltura 19-21. Inoltre, questo modello consente esame diretto della crescita ossea lineare che non è possibile in colture di condrociti primari. Esso permette anche la separazione dei fattori sistemici e locali permettendo quindi l&#39;analisi specifica degli effetti locali sulla piastra di crescita. La cultura del metatarsi permette lo studio di numerosi parametri. misurazioni giornaliere di lunghezza totale e delle regioni di mineralizzatii rudimenti possono essere eseguite con microscopio a contrasto di fase di serie e il software di analisi delle immagini. Istologica, ibridazione in situ e la colorazione immunoistochimica può essere facilmente eseguita su sezioni metatarsali, che permette la risoluzione spaziale di entrambe le entità cellulari e molecolari, un importante vantaggio rispetto ai metodi tradizionali di coltura cellulare. L&#39;approccio immunoistochimica include il rilevamento e la quantificazione di 5-bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU) assorbimento da proliferazione condrociti 22. Inoltre, ulteriore trattamento di tessuti metatarsali può essere effettuato per consentire un&#39;analisi valle di mRNA (RT-qPCR), proteine ​​e analisi segnale intracellulare (Western blotting) o la composizione lipidica (spettrometria di massa). La maggior parte degli studi fino ad oggi utilizzano metatarsi embrionali in coltura piuttosto che metatarsi da animali post-natale. Mentre entrambi i modelli possono essere informativo, lo studio delle ossa embrionali ha diversi vantaggi: crescono più velocemente e può essere exploited per studiare l&#39;inizio e la progressione del 23-25 processo di mineralizzazione. Questo protocollo descrive in dettaglio la dissezione intricata di metatarsi embrionali dalla dell&#39;arto posteriore di giorno embrionale 15 (E15) embrioni murini. Inoltre, viene mostrato la crescita e la mineralizzazione dei metatarsi anatomicamente distinte.

<table><tbody><tr><td>Dissection scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #5 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #4 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>SuperFine Vannas scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Dilute to 70% v/v in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM without nucleosides</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters (0.22 &amp;mu;m) 33 mm diameter</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Add directly to the media prior to experimentation</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td>Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Nunc cell-culture treated 24-well plates</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

Lo scopo di questo metodo è per isolare metatarsi e li cultura embrionali per l&#39;esame della crescita ossea longitudinale ed ECM mineralizzazione. Utilizzando il nostro protocollo qui descritto, ossa del metatarso embrionali sono stati sezionati con successo, come visualizzato al microscopio ottico. Misure di ossa metatarsali, condotti come indicato nella figura 1, hanno mostrato la loro capacità di crescere in lunghezza longitudinale ed mineralizzare loro ECM (figure 2 e 3). Mineralizzazione della matrice viene prima osservato nella metà diafisi del rudiment dell&#39;osso ed è facilmente osservata al microscopio ottico. Nessuna colorazione è richiesto anche se l&#39;assorbimento di calceina può offrire una migliore visualizzazione del minerale di nuova formazione. Gli studi che utilizzano metatarsi embrionali per data 22,27,28 hanno messo in comune la sezionato 2 °, 3 ° e 4 ° (CENtrali tre) metatarsi, assumendo in crescita in vitro e la mineralizzazione per essere comparabili. In vivo dello sviluppo di metatarsi murini, tuttavia, rivela che i 3 ° e 4 ° cifre hanno evidenza di mineralizzazione prima di tutti gli altri metatarsi e falangi 29. Valutazione del potenziale di crescita e la mineralizzazione della singolarmente isolate e coltivate E15 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso ha rivelato differenze significative nella comparsa o alla portata di mineralizzazione dopo 7 giorni di coltura (Figura 2). Nessuna differenza nella percentuale di aumento dal basale è stata rilevata durante il periodo di coltura. Come è stato notato differenze nel potenziale di mineralizzazione il protocollo standard di mettere in comune i 2 ° 3 ° e 4 ° metatarso appare valida per gli studi futuri. Tradizionalmente, gli investigatori hanno aggiunto βGP ai mediautilizzato per cultura metatarsi embrionali per promuovere ECM mineralizzazione. Tuttavia, in studi di coltura cellulare, è stato dimostrato che se TNAP enzima viene aggiunto al supporto osteogeniche contenenti βGP, ectopica deposizione minerale idrossiapatite persiste anche in assenza di cellule 30. Per esaminare gli effetti dei vari substrati di mineralizzazione e agonisti sulla capacità metatarso mineralizzazione, abbiamo colto metatarsi E15 in terreni di coltura contenente una gamma di integratori, e le immagini e le misure di lunghezza sono stati registrati tutti i giorni. I risultati hanno indicato che la E15 ossa del metatarso ancora crescere e mineralizzano la ECM, in assenza di βGP. E15 metatarsale coltivate in acido ascorbico solo media hanno mostrato aumenti comparabili lunghezza e mineralizzazione come metatarsi coltivate in presenza di βGP (figura 3). Abbiamo anche dimostrato che lentivirus può essere utilizzato per trasfettare DNA esogeno in Metata coltarsals. Qui abbiamo trasfettato con successo ossa del metatarso del giorno 0 della cultura (cioè giorno di dissezione) con 2 x 10 6 verdi particelle virali proteina fluorescente (GFP) per metatarso. Per abilitare la trasduzione del virus, polibrene è stato contemporaneamente aggiunta alle culture a 1: 500. Le colture sono state lasciate per 7 giorni, senza modifiche di supporto come richiesto per E15 metatarso mineralizzazione a verificarsi, prima di essere incubate con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) macchia per 5 minuti e poi direttamente visualizzati utilizzando un microscopio confocale ( Figura 4). La nostra prova di esperimenti concettuali mostrano chiaramente trasduzione efficace. Tuttavia sarebbe opportuno esaminare sezioni durante l&#39;interezza del metatarso per valutarne la trasfezione ed efficace manipolazione genetica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> Figura 1: metodologia standard usato per misurare tegli lunghezza e la mineralizzazione zona di embrionali Metatarso. (A) Misure totali di lunghezza di metatarsi E15 il giorno 0 della cultura (giorno di dissezione) presa attraverso il centro del metatarso. (B) Le misure di lunghezza longitudinale totale di un metatarso dopo sette giorni in coltura. Si noti la leggera curvatura del metatarso. (C) Misurazione della lunghezza della zona di mineralizzazione dopo sette giorni di coltura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> Figura 2: crescita e mineralizzazione capacità di anatomicamente distinto E15 Metatarso Imaging e misura del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso dalla dell&#39;arto posteriore di topi E15 w.interpretato. (A) le immagini seriali del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso per tutto il periodo di coltura. (B) Aumento percentuale in lunghezza da giorno 0 ad ogni giorno di coltura. (C) Lunghezza minerale del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarsi nel periodo di coltura espresso come percentuale della lunghezza totale metatarso. Dati in sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM), (n = 6). (D) C57Bl / 6J metatarsali lunghezze in ogni giorno della cultura. Dati in sono rappresentati come media ± deviazione standard (n = 6). Nero bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> Figura 3: la crescita e la mineralizzazione capacità di Wild-typeE15 Metatarsi coltivate in vari media Osteogenic. (A) le immagini seriali di metatarsi coltivate in acido ascorbico solo 1 mm βGP 3 mm phosphocholine, cloruro di calcio 1,5 mm o cloruro di calcio 3 mM contenente supporti. (B) aumento percentuale in lunghezza da giorno 0 del metatarso coltivate con i vari supplementi. (C) Lunghezza minerale di metatarsi coltivate in vari media espressa come percentuale della lunghezza totale metatarso. I dati sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM), (n = 6). Nero bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> Figura 4: Transfection di E15 Metatarso con GFP virus Particoli. ossa del metatarso (A) E15 sono state trasfettate con particelle virali GFP per proof of concept. (B) Le ossa sono state colorate con DAPI per la visualizzazione del DNA. (C) Due immagini indicate trasfezione successo del virus GFP tutta la totalità delle ossa del metatarso. Barre bianche = 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K Views.  The University of Edinburgh. We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development. 

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy human bones makes particularly valuable the use of mammalian models, such as mouse and rat, to look into different aspects of bone growth and homeostasis. Additionally, the development of sophisticated genetic tools in mice allows more complex studies of long bone growth and asks for an expansion of techniques used to study bone growth. Here, we present a detailed protocol for ex vivo murine bone culture, which allows the study of bone and cartilage in a tightly controlled manner while recapitulating most of the in vivo process. The method described allows the culture of a range of bones, including tibia, femur, and metatarsal bones, but we have focused mainly on tibial culture here. Moreover, it can be used in combination with other techniques, such as time-lapse live imaging or drug treatment.

Here, we present a method for ex vivo culture of long murine bones at both fetal and newborn stages, suitable for analyzing bone and cartilage development and homeostasis in controlled conditions while recapitulating the in vivo process.

Coltura e misurazione ossa lunghe e fetali di murina neonatale

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del Blastema mammario e sull'ossificazione intramembranosa

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A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Medicina

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Un modello come minimo dilagante per analizzare Endochondral frattura la guarigione nei topi in condizioni standardizzate di biomeccaniche

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

La generazione delle fratture chiuse femorale in topi: un modello per studiare la guarigione ossea

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

Studio preciso sulle lesioni della cartilagine di crescita utilizzando topi fluorescenti trilineage

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones are overloaded.&#160;Better treatments for severely fractured growth plates are needed because the response to injury is a bony bridge that prematurely fuses the growth plate, leading to stunted and/or crooked limbs. Murine models of growth plate injury are advantageous for mechanistic studies, but&#160;are challenging because it is difficult to visualize and precisely injure the small growth plates in young mice.&#160;We describe here an improved growth plate injury model using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X.
These mice show native fluorescence associated with the three primary substrata of the growth plate. A growth plate injury similar to a Salter-Harris Type II injury is created reproducibly with a bur using the hypertrophic section of the growth plate as a reference during live imaging under fluorescence stereo microscopy guidance. Frozen histology analysis of the native fluorescence simplifies assessing the cellular response to injury. This methodology represents a substantial leap in growth plate injury research, providing a detailed and reproducible method for investigating pathology and evaluating new therapeutic strategies.

Autore in primo piano: Avanzamento del modello di lesione della cartilagine di crescita utilizzando reporter fluorescenti trilineage nei topi

This protocol describes an improved mouse model for adolescent bone growth plate injuries. Using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X, the primary matrices associated with three different substrata of the growth plate, injury placement is guided by native fluorescence under the microscope.

Modello murino transgenico tricolore per lo studio delle lesioni della cartilagine di crescita

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

Riepilogo

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Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

Un modello come minimo dilagante per analizzare Endochondral frattura la guarigione nei topi in condizioni standardizzate di biomeccaniche

La generazione delle fratture chiuse femorale in topi: un modello per studiare la guarigione ossea

Modello murino transgenico tricolore per lo studio delle lesioni della cartilagine di crescita

Modello murino transgenico tricolore per lo studio delle lesioni della cartilagine di crescita

Modello murino transgenico tricolore per lo studio delle lesioni della cartilagine di crescita