L'amputazione P3 è un modello preclinico per lo studio della rigenerazione epimorfa dei mammiferi e un potente strumento per identificare le popolazioni cellulari critiche e i meccanismi che controllano la rigenerazione endogena. Il modello P3 consente l'identificazione delle popolazioni di cellule blastemali precoci e tardive, lo studio della rivascolarizzazione durante la rigenerazione e lo studio dell'ossificazione intramembranosa senza complessi requisiti del dispositivo di stabilizzazione ossea. A dimostrare la procedura con me saranno Osama Qureshi, Alyssa Falck e Katherine Zimmel, tecnico, e Regina Brunaeur, un assistente di ricerca professore tutto del nostro laboratorio.
Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito in un mouse CD-1 di otto-12 settimane, applicare un unguento agli occhi dell'animale e posizionare il mouse sotto un microscopio a dissezione 10X. Utilizzare iodio povidone chirurgico e 70%etanolo per sterilizzare le cifre di ogni arto posteriore e utilizzare microscissori per tagliare i capelli lontano dal sito chirurgico. Applicare localmente un microlitro di bupivacaina topica per anestetizzare il sito chirurgico e svasare delicatamente una zampa posteriore per esporre la superficie della cifra mediale.
Quindi tenendo il bisturi ad un angolo parallelo al cuscinetto grasso, utilizzare un bisturi sterile numero 10 per amputare la punta distale della falange terminale delle cifre due e quattro. Applicare localmente un microlitro aggiuntivo di bupivacaina su ogni cifra amputata e riportare il mouse in una gabbia pulita per consentire alle ferite di guarire senza medicazione della ferita e con monitoraggio fino alla piena reclinabilità. Per garantire un piano di amputazione P3 di successo, tenere il bisturi parallelo al cuscinetto grasso durante l'amputazione ed eseguire la scansione micro-CT per confermare la corretta lunghezza di amputazione.
All'endpoint sperimentale appropriato, utilizzare un bisturi per ertare la cifra a metà della falange centrale all'indentazione approssimativamente del secondo cuscinetto di grasso ventrale. Trasferire il tessuto in una fiala a scintillazione da 20 millilitri contenente 10 millilitri di zinco fresco tamponato formalina fissante per 24-48 ore. E utilizzare un microtomo per acquisire sezioni spesse da quattro a cinque micrometri di ogni cifra, posizionando le fette in un bagno d'acqua da 38 a 41 gradi Celsius integrato con una soluzione adesiva istologica man mano che si ottengono.
Quindi catturare le fette su diapositive adesive e posizionare le diapositive su uno scivolo Celsius di 37 gradi per asciugare. Quando le diapositive sono state deparaffinizzate immergere i campioni in un barattolo di colorazione di un'appropriata soluzione di recupero dell'antigene e riscaldare le diapositive a 95 gradi Celsius per 25 minuti assicurandosi che l'ebollizione non si verifichi. Alla fine dell'incubazione, lasciare che il barattolo venga a temperatura ambiente e posare gli scivoli piatti in una scatola di plastica coperta profonda un pollice con carta velina inumidita alla base.
Aggiungere 100 microlitri di proteinasi K prebellica ad ogni campione. Coprire ogni diapositiva con una piccola striscia di parafilm per assicurarsi che le sezioni non si asciughino. Dopo 12 minuti a 37 gradi Celsius, rimuovere con cura il film di paraffina e scolare delicatamente le diapositive su carta velina per rimuovere la soluzione di blocco in eccesso.
Successivamente, aggiungere da 100 a 200 microlitri della soluzione anticorpale primaria di interesse per ogni diapositiva. Riportare i siti nella camera umidificante coperta da pellicola di paraffina per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina dopo aver lavato le diapositive in soluzione salina tamponata TRIS più TWEEN o TBST etichettare le diapositive con un'appropriata soluzione anticorpale secondaria per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce.
Alla fine dell'incubazione, lavare gli scivoli in TBST e lasciare asciugare. Utilizzare quindi 100 microlitri di mezzo di montaggio anti dissolvenza per posizionare con cura le coverlips sugli scivoli essiccati e conservare gli scivoli piatti a temperatura ambiente durante la notte protetti dalla luce per consentire al mezzo di montaggio di asciugarsi. Per la tomografia micro-calcolata sequenziale in vivo o la micro-TC, l'imager micro-CT è dotato di tubi per consentire il flusso di ossigeno all'interno e all'esterno della camera animale micro-CT, assicurandosi che l'ossigeno in uscita sia dotato di un filtro a carbone attivo per intrappolare l'isoflurane.
Impostare Voxelsize su 10,5 micrometri a 55 kilovoltage di picco e 145 microarti con 1.000 proiezioni per 180 gradi e rotazione continua con un tempo di integrazione di 200 millisecondi, con un massimo di 213 fette per scansione. Quando lo scanner è pronto, posizionare delicatamente il mouse anestetizzato nella camera animale micro-CT con le cifre degli arti posteriori disposte in piano, chiudere il lato ventrale di associazione verso l'alto con la zampa sinistra sul lato sinistro e la destra sul lato destro della piattaforma di scansione. Quindi applicare il nastro chirurgico per fissare delicatamente le cifre in posizione.
Applicare unguento oftalmico agli occhi dell'animale prima di iniziare la scansione. Dopo la scansione, riportare l'animale in una gabbia pulita con monitoraggio fino alla piena rimi clemenza e consentire fino a diverse ore per la ricostruzione delle immagini micro-CT. Per l'analisi dell'immagine ossea 3D ricostruita, utilizzando il software fornito con la micro-TC, convertire i file di immagine in una serie di file DICOM.
Una volta convertiti tutti i file, scaricare la serie DICOM in un'unica cartella utilizzando un downloader di file batch in un browser Web. Caricare il plug-in BoneJ nella cartella del plug-in ImageJ. Trascinare la cartella della serie di file DICOM nella barra ImageJ per aprire i file.
Verrà aperto uno stack di immagini a 16 bit che visualizza tutti i valori grigi. Per visualizzare solo le ossa, fare clic su Regolazione immagine e Soglia. Far scorrere la barra di soglia superiore all'estrema destra e regolare la barra di soglia inferiore fino a quando solo l'osso non viene evidenziato in rosso.
Il valore soglia inferiore sarà approssimativamente da 10.000 a 13.000 ad un'intensità massima del segnale di 32.767. Fare clic su Applica e nella nuova finestra di dialogo fare clic su Sfondo nero. Fare quindi clic su OK. Verrà generata un'immagine a otto bit che mostra i valori in bianco e nero.
Con il bianco corrispondente all'osso. Disegna un rettangolo attorno all'osso P3 per selezionarlo e duplicare la pila. Per generare un'immagine 3D, fare clic su Plugin e Visualizzatore 3D e utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per cerchiare l'osso da eliminare.
Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Selezione riempimento per ritagliare qualsiasi osso non necessario dall'immagine. Per quantificare il volume osseo dal rendering 3D, aprite il plug-in BoneJ e selezionate Frazione volume (Volume Fraction). Verrà visualizzata una finestra dei risultati e verrà visualizzato il volume osseo in millimetri al cubo.
Per quantificare la lunghezza ossea del rendering 3D, usate lo strumento multipunto ImageJ. Per acquisire un'immagine del rendering 3D, fare clic su Visualizza e scattare un'istantanea. Quindi salva l'immagine come file TIF o JPEG.
In queste immagini sezioni di un topo adulto rigenerante P3 digit sono state immunostained con anticorpi per visualizzare la rigenerazione ossea intramembranosa e la formazione di blastema al giorno da sei a sette, nove e 10 post-amputazione. Qui vengono mostrati rendering rappresentativi micro-CT di cifre scansionate prima dell'amputazione e in vari punti di tempo nel corso della rigenerazione con punti di riferimento utilizzati per identificare le misurazioni della lunghezza. Il modello a cifre del mouse è un potente sistema per analizzare un ambiente pro-rigenerativo della ferita che innesca la formazione di blastema quando viene amputato a livello distale.
Al contrario, l'amputazione prossimale delle cifre funge da sistema modello per lo studio del fallimento rigenerativo e da un sito per testare strategie per migliorare la rigenerazione.
