Questo metodo adatta il protocollo di coltura metatarsale alle ossa più grandi, consentendo di izzare la manipolazione ossea diretta con modelli genetici complessi per affrontare i processi legati allo sviluppo osseo. Questa tecnica consente la manipolazione e l'analisi della crescita ossea che non sono possibili in vivo, come l'imaging dal vivo o la manipolazione fisica e farmacologica diretta. Questo metodo di coltura ex vivo consente lo studio specifico degli effetti locali dell'insorgenza genetica nell'osso che lo separa dall'effetto sistemico che il trattamento ha sull'organismo.
Inizia sterilizzando la regione addominale di un giorno gestazionale incinta da 14,5 a 18,5 topo con 80%etanolo e usando piccole forbici per aprire la pelle e i muscoli addominali per accedere alle corna uterine. Per estrarre l'utero dalla cavità addominale, rimuovere il mesometrio e tagliare la base delle corna. Quindi, trasferire l'utero in una piastra di petri di 60 millimetri contenente mezzo di dissezione ghiacciato sul ghiaccio.
In un armadio di biosicurezza tagliato tra i sacchi con forbici per separare i singoli feti e trasferire un singolo sacco in un nuovo piatto da 60 millimetri con mezzo di dissezione fresco sotto un microscopio stereo a dissezione. Utilizzare una pinzetta per separare i feti dalle placenta e per pulire i feti dalle membrane. Utilizzare una pipetta di plastica tagliata per trasferire il corpo in un nuovo piatto da 60 millimetri e decapitare l'embrione prima di un'ulteriore dissezione.
Quindi utilizzare una pinzetta per rimuovere la pelle, partendo dalla parte posteriore e staccandosi alle dita dei piedi. Usa le pinzette per tagliare vicino alla colonna vertebrale e separare gli arti posteriori dal corpo. Trasferire gli arti posteriori in un piatto pulito contenente mezzo di dissezione ghiacciato e inserire le pinzette tra la cartilagine superficiale del femore distale e la tibia prossimale per separare la tibia dal femore.
Rimuovere le ossa dell'anca dal femore prossimale e dall'osso calcaneo e dalla fibula dalla tibia. Stroncare e estrarre con cura i tessuti molli dai femminicidi e dalle tibia e utilizzare una pipetta sterile da un millilitro per trasferire tutte e quattro le ossa delle gambe nel primo pozzo di una piastra da 24 pozzetti contenente mezzo di dissezione fresco. È importante dimostrare che il tessuto molle che collega il polso dell'osso viene rimosso.
Altrimenti, l'osso si piegherà e non raggiungerà una crescita adeguata. Quando le ossa sono state sezionate dal numero sperimentale appropriato di feti, immaginiamo le ossa in ogni pozzo a volte zero sotto un microscopio leggero con un buon contrasto e sostituisci il mezzo di dissezione in ogni pozzo con un millilitro di mezzo di coltura per pozzo facendo particolare attenzione a non aspirare le ossa. Per osservare l'effetto dell'inibizione della crescita nelle condizioni di coltura, trattare le tibia sinistra con acido retinoico nanomolare 500 e incubare le tibia destra con un volume equivalente di veicolo come controllo.
Quindi, posizionare la piastra in un incubatore di coltura cellulare in condizioni standard di coltura cellulare. Dopo due giorni, trattare le ossa con un analogo di timmidina appropriato per una o due ore per valutare la proliferazione delle cellule ossee prima di trasferire le ossa in singoli tubi da due millilitri del 4% di paraformaldeide per 10 minuti. Quindi, trasferire le ossa su PBS per imageare le ossa nel momento finale prima di restituire i campioni alla paraformaldeide per la fissazione notturna a quattro gradi Celsius.
Per misurare la lunghezza e la regione mineralizzata delle ossa, aprire un programma software di imaging appropriato e, tenendo conto della scala dell'immagine, misurare sia la lunghezza totale dell'osso, sia la regione mineralizzata. Avvio delle misurazioni dalle prime celle scure da un'estremità fino alle ultime celle scure all'altra estremità. Per calcolare il tasso di crescita definito come l'aumento medio della durata al giorno, dividere la differenza tra la lunghezza finale dell'osso e la durata iniziale per il numero di giorni in coltura.
Qui viene mostrato un confronto tra tibia coltivata e tibia appena estratta in fasi equivalenti. Dopo un massimo di due giorni di coltura, la dimensione raggiunta è paragonabile alla crescita ossea in vivo sia per la cartilagine che per l'osso mineralizzato. Periodi di coltura più lunghi portano a maggiori differenze tra le ossa coltivate e le ossa appena estratte.
Nota, la tibia coltivata con una rimozione incompleta del tessuto molle può causare la flessione della tibia coltivata. Il trattamento con acido retinoico ha un effetto robusto sulla crescita tibiale già dopo due giorni di trattamento. Sebbene vi sia un aumento costante della lunghezza totale della tibia dopo due giorni di coltura, questa crescita corrisponde ad un aumento approssimativo di soli nove-29% rispetto alla lunghezza iniziale.
Meno dell'aumento della crescita ossea che si osserverebbe in vivo. In effetti, l'etichettatura analogica della timmidina mostra meno cellule positive in questa regione dopo la coltura rispetto alle ossa appena estratte di uno stadio equivalente. Inoltre, nella tibia coltivata in vitro, la lunghezza totale dell'elemento scheletrico aumenta notevolmente, mentre quasi nessun aumento della regione mineralizzata è osservato.
Oltre all'analisi istologica e molecolare, la compensazione e l'imaging 3D possono essere eseguite dopo la coltura per caratterizzare l'effetto cellulare dei trattamenti applicati alle ossa coltivate. La tecnica ci permette di affrontare domande relative alla comunicazione interorganale. Ad esempio, co-coltivando ossa dei diversi modelli genetici in una sorta di esperimento di parabiosi indolore.
