Nel modello di silicosi murina descritto generato dall'infusione intralaser di polvere di silice cristallina, tutte le sospensioni CSD hanno simulato più volte l'insorgenza e lo sviluppo della silicosi umana in larga misura. Questo metodo consente di risparmiare tempo e di livello, oltre che pratico ed efficace. Inoltre, non provoca lesioni meccaniche al tratto respiratorio superiore a causa dell'operazione.
Questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per preparare modelli di malattia di virus, batteri, eccetera. A dimostrare la procedura sarà Hangbing Cao, uno studente del mio laboratorio, esperto nella preparazione del modello murino di silicosi. Iniziare con la preparazione della polvere di silice cristallina o CSD almeno un giorno prima di somministrare le flebo nasali.
Per fare ciò, macinare la silice in un mortaio di agata per mezz'ora. Per controllare la dimensione e la forma delle particelle, preparare il campione per la microscopia elettronica a scansione o SEM utilizzando un nastro conduttivo per legare le particelle di silicio. Usando un asciugacapelli, soffia via delicatamente le particelle non saldamente legate prima di procedere all'acquisizione dell'immagine.
Successivamente, miscelare la silice macinata e la soluzione salina sterile a una concentrazione di 20 milligrammi per millilitro utilizzando un agitatore a ultrasuoni. Infine, agitare la sospensione CSD preparata per 10 secondi. Somministrare 50 microlitri di CSD al topo anestetizzato tramite una flebo nasale per quattro-otto secondi.
Trattare il mouse di controllo con una quantità uguale di soluzione fisiologica, quindi tenere il corpo del mouse con il palmo, pizzicare la pelle sulla parte posteriore del collo con il pollice e l'indice mentre si fissano gli arti posteriori del mouse con le altre dita. Premere delicatamente l'area del battito cardiaco del mouse con l'altro dito indice da cinque a 10 volte per cinque secondi. Riscaldare il tessuto polmonare incorporato in paraffina su una piastra calda a 60 gradi Celsius per oltre quattro ore.
Per decerare e idratare la sezione di paraffina, immergere il vetrino in xilene per 30 minuti due volte, quindi immergere in sequenza il vetrino per cinque minuti ciascuno in etanolo anidro al 95% 85% e al 75% e, infine, in acqua deionizzata, quindi posizionare il vetrino nel secchio per colorare l'ematossilina per 10 minuti prima di risciacquare delicatamente sotto l'acqua corrente per cinque minuti. Immergilo nel secchio per colorare l'eosina per 10 secondi. Dopo aver disidratato il campione in etanolo anidro al 75% 85% e anidro per cinque minuti ciascuno, pulire la sezione di tessuto immergendola in xilene per cinque minuti e sigillarla con circa 60 microlitri di gocce di resina neutra.
Posizionare con cautela il vetrino del coperchio sulla sezione. Per la colorazione di Masson, colorare i campioni di paraffina decerati e idratati con ematossilina di Weigert al 50% appena preparata per 10 minuti, quindi dopo aver immerso il tessuto in liquefazione acida di etanolo per 10 secondi, risciacquare delicatamente il vetrino con acqua corrente per l'azzurramento dei nuclei. Successivamente, colorare il campione con gocce di soluzione colorante rossa per sette minuti e lavare con una soluzione di lavoro di acido cloridrico al 30% per un minuto.
Dopo aver immerso il vetrino in alcol al 95% per 20 secondi, disidratare il campione con etanolo anidro per uno o tre secondi due volte e, come dimostrato in precedenza, pulire e sigillare il campione. Per la colorazione rosso Sirius, infiltrare la sezione decerata e idratata per un'ora con la soluzione colorante rosso Sirius, quindi colorare i nuclei cellulari per 8-10 minuti con la soluzione colorante Mayer hematoxlyn. Sciacqualo delicatamente sotto l'acqua corrente per 10 minuti prima di disidratarlo, pulirlo e sigillarlo.
Infiltrare il campione di paraffina decerata e idratata con 30 millilitri di una soluzione di recupero dell'antigene EDTA da tre milligrammi per millilitro. Far bollire il campione per 20-30 minuti prima di lavarlo con acqua deionizzata e incubarlo in PBST per cinque minuti. Immergere il campione per 15 minuti con una soluzione di perossido di idrogeno allo 0,3% appena preparata e lavarlo tre volte per cinque minuti ciascuna con PBST.
Permeabilizzare la membrana del campione per 15 minuti con una soluzione di Triton 100 allo 0,3% e bloccare con 30-40 microlitri di albumina sierica bovina al 5% o BSA per un'ora. Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, aggiungere gli anticorpi primari NF-kappa B e CD-68 opportunamente diluiti e incubare il campione per una notte a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius in un vetrino da microscopio IHC wet box. Il giorno successivo, dopo aver trasferito il campione a temperatura ambiente per un'ora, lavarlo tre volte per cinque minuti ciascuna con PBST.
Incubare il campione per un'ora in anticorpi secondari marcati con perossidasi di rafano anti-topo di coniglio a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare nuovamente i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno con PBST, quindi incubare il campione con il substrato DAB corrispondente all'anticorpo marcato con enzima per 5-20 minuti. Dopo aver spento la reazione con acqua deionizzata, colorare il campione per 30 secondi con l'ematossilina di Weigert.
Sciacqualo sotto l'acqua corrente per un minuto, disidratalo, puliscilo e sigilla il tessuto. Prima di procedere all'analisi western blot, omogeneizzare il tessuto con la soluzione di lavoro RIPA su ghiaccio per cinque minuti utilizzando una smerigliatrice elettrica portatile. Incubare per un'ora su ghiaccio agitando e centrifugare l'omogenato a 14.800 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Raccogliere il surnatante e determinare la concentrazione proteica con un kit per il dosaggio delle proteine BCA. Aggiungere 20 microlitri di tampone di caricamento 5X al surnatante, quindi riscaldare la soluzione di conservazione delle proteine da sei microgrammi per microlitro preparata con RIPA in un bagno di metallo a 100 gradi Celsius per 20 minuti. Conservare 100 aliquote di microlitri della soluzione proteica in ciascuna provetta a meno 80 gradi Celsius.
Per l'elettroforesi, diluire le aliquote a due o tre microgrammi per microlitro con lisato RIPA, quindi aggiungere 20 microgrammi di campione per pozzetto per far scorrere il gel. Trasferire la proteina su una membrana in PVDF pre-attivata con metanolo per 20 secondi utilizzando il metodo di trasferimento a umido con corrente di 400 milliampere per una o due ore. Dopo aver lavato la membrana cinque volte per cinque minuti ciascuna con soluzione PBST, bloccare con 5% BSA o latte scremato per un'ora.
Immergere le strisce nella soluzione di anticorpi primari contenente NF-kappa B e beta actina diluita con il 5% di BSA. Agitare delicatamente le strisce durante la notte a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius prima di lavarle con PBST. Successivamente, incubare le strisce, prima nell'anticorpo secondario diluito per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente, e poi con uno sviluppatore a chemiluminescenza potenziato per tre minuti.
Esporre la striscia a un gel imager per 20 secondi e misurare il valore di grigio della striscia per valutare il livello proteico tramite il software di sistema. Le immagini SEM di CSD hanno mostrato che le particelle erano di forma irregolare. La colorazione rossa di Sirius eseguita per misurare la deposizione di collagene ha mostrato che la progressione della fibrosi polmonare nei topi è stata significativamente accelerata dopo l'esposizione a CSD per un mese.
La microscopia polarizzante ha rivelato tre diversi tipi di fibre di collagene, di cui le fibre di collagene di tipo uno mostrate in rosso sono un fattore di rischio per la silicosi, tuttavia, non è stata riscontrata alcuna fibrosi significativa nel gruppo del veicolo. Ciò è stato indicato anche dai rispettivi punteggi di fibrosi. La colorazione HE del tessuto polmonare di topo trattato con CSD ha mostrato tipici noduli di silice caratterizzati da necrosi liquefatta dopo fagocitosi di CSD al centro circondata da macrofagi in periferia.
La colorazione di Masson ha anche mostrato che i noduli erano arricchiti con CSD accompagnata da fibrosi. La colorazione immunoistochimica di CD-68 ha inoltre rivelato l'ampia presenza di macrofagi nel tessuto polmonare. La microscopia a luce polarizzata ha mostrato che questi macrofagi avevano ingerito CSD, causando gravi lesioni polmonari.
La colorazione immunoistochimica ha mostrato una maggiore colorazione di NF-kappa B, indicando una maggiore risposta infiammatoria nel gruppo trattato con CSD rispetto al gruppo veicolo. Il western blot rappresentativo ha anche mostrato che i topi trattati con CSD avevano una maggiore espressione di NF-kappa B nel polmone e la differenza di espressione tra i due gruppi era significativa. Per evitare l'ostruzione respiratoria e favorire il recupero respiratorio, l'area cardiaca del topo deve essere massaggiata delicatamente da cinque a 10 volte, come dimostrato dopo un periodo di cinque secondi.
Questo modello può esplorare alcuni meccanismi alla base della silicosi e aiutare lo screening terapeutico dei farmaci, oltre a stabilire parametri cruciali come il dosaggio e la durata. Questa tecnologia offre un mezzo conveniente, efficace ed economico per esporre i modelli murini al particolato, indipendentemente dal fatto che si aggiungano batteri. Il monitoraggio del comportamento dei topi può aiutare a determinare i potenziali effetti dell'inalazione di particolato.
