I nostri metodi delineano un modo semplice e ripetuto per studiare la nanotossicità, come esaminare i tipi di morte cellulare ed esaminare la produzione di specie reattive dell'ossigeno. Lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza è un formato rigoroso che ci consente di studiare la sottopopolazione delle cellule e i diversi tipi di morte cellulare in crescita. Il metodo di studio della sonda DHE ci consente di rilevare e quantificare le specie reattive dell'ossigeno seguite dalla citometria del flusso, dall'imaging microscopico ad alto contenuto e dall'analisi della fluorescenza basata sull'accoppiato.
Per iniziare, posizionare un tubo di Eppendorf contenente nanoparticelle di ossido di zinco nella soluzione di stock di nanoparticelle di ossido di zinco in un sonicatore per 15 minuti. Preparare nanoparticelle di ossido di zinco a varie concentrazioni utilizzando lo stock di nanoparticelle di ossido di zinco da un milligrammo per millilitro. Quindi, in un armadietto per la biosicurezza, seminare fibroblasti polmonari umani MRC5 su tre piastre di coltura a sei pozzi alla concentrazione di una per 10 alla quinta cellule per pozzo.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Dopo un giorno, trattare le cellule con due millilitri di nanoparticelle di ossido di zinco per otto ore, 16 ore o 24 ore. In ogni momento, raccogliere le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 300 volte g per cinque minuti.
Lavare i pellet cellulari due volte con soluzione salina tamponata con fosfato, quindi rimossare le cellule con tampone di legame 1X. Aggiungere quindi cinque microlitri della macchia FITC Annexin V in cinque microlitri di macchie di DNA di ioduro di propidio. Incubare le celle macchiate per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
Prima di ordinare le cellule per citometria a flusso, ricaricare i campioni con altri 400 microlitri di buffer di legame 1X. Tabulare il grafico a barre utilizzando l'intensità mediana ottenuta. Ora usa una pipetta per aggiungere un millilitro di nanoparticelle a diverse concentrazioni in fiale, seguito da nove millilitri di cibo a mosca per fare una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro, 0,25 milligrammi per millilitro o 0,5 milligrammi per nanoparticelle di ossido di zinco millilitro.
Pipetta su e giù per mescolare accuratamente. Lasciare raffreddare il cibo a mosca contenente nanoparticelle di ossido di zinco per almeno due o tre ore prima dell'uso. Quindi anestetizza le mosche adulte maschili e femminili in una fiala con anidride carbonica e introduci cinque mosche maschili e cinque mosche femminili in ogni fiala per cinque giorni.
Consentire loro di accoppiarsi e deporre le uova sulla superficie del cibo. Dopo l'anestesia, rimuovere le mosche parentali e consentire alle uova di subire un ulteriore sviluppo a temperatura ambiente, che consiste in quattro diversi stadi di sviluppo. Stadio embrionale, larvale, pupale e adulto.
Dopo 72-120 ore, le uova appena deposte si sviluppano in larve instar alla fine del terzo. Usando le forcep, raccogliere le larve dal muro delle fiale per le analisi. In un pozzo di un piatto di dissezione con mezzo di dissezione o PBS, posizionare le larve nella soluzione.
Sotto lo stereomicroscopio, usa la punta delle forcep per fare un piccolo buco e apri lo strato di cuticola delle larve. Estrarre con cura l'intestino. Posizionare l'intestino in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente drosophila medium di Schneider.
Aggiungere un microlitro della sonda DHE e incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti. Lava l'intestino tre volte usando Schneider's Medium ogni cinque minuti. Montare l'intestino su vetrini e fornire 10 microlitri di supporto antifade contenente DAPI.
Cattura le immagini al microscopio confocale. Per misurare la fluorescenza, importare le immagini a fluorescenza acquisite utilizzando la microscopia a fluorescenza o la microscopia a scansione laser confocale nel software ImageJ. Fare clic sul menu analizza e selezionare imposta misure.
Selezionare la misura di output, ad esempio l'intensità integrata nell'area e il valore grigio medio. Selezionate una regione senza fluorescenza per impostare lo sfondo. Fare clic su misura.
Esportare i dati nel foglio di calcolo e determinare la fluorescenza totale corretta delle celle. Costruire un grafico a barre ed eseguire analisi statistiche. In questo studio, le cellule trattate con nanoparticelle di ossido di zinco mostrano una percentuale più alta di cellule R6 apoptotiche precoci o tardive rispetto alle cellule di controllo R5. La morte necrotica delle cellule è stata denotata da R4. L'intestino estratto dalla larva di drosophila era diviso in tre domini discreti di diversa origine dello sviluppo.
Vale a dire, il foregut, il midgut e l'hindgut. Le azioni DHE tendono a scadere piuttosto rapidamente, quindi fai attenzione alla soluzione stock che stai utilizzando. In alternativa, potresti provare altre sonde, ad esempio la cella Roche, progettata per rilevare il ROS intracellulare nei segnali verdi, e questo è più fototabella del DHE.
Il nostro protocollo fornisce uno schema generale per lo studio della produzione di ROS intracellulare e la quantificazione del livello ROS per lo studio della nanotossicità. DMSO è noto per essere un solvente migliore per il DHE rispetto al PBS. Tuttavia, dmso è tossico.
Pertanto, vorrei consigliare all'utente di limitare l'intero processo di studio a 30 minuti al massimo. Questo perché è possibile osservare un risultato falso positivo in quanto DMSO può causare la morte cellulare.
