In questo protocollo dettagliamo un modello in vitro di tauopatia umana. Questo metodo riempie un'esigenza di materiali che può essere utile per lo screening dei farmaci e gli studi sul meccanismo delle malattie. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il paradigma della coltura cellulare consente una valutazione più rapida della tossicità tau e delle potenziali terapie tau rispetto agli studi sugli animali Per iniziare questa procedura scongelare il rivestimento a matrice di membrana basale per piastre di coltura a quattro gradi Celsius.
Crea aliquote di un millilitro e conservale a meno 20 o meno 70 gradi Celsius. Successivamente, ricostituire il fattore di crescita dei fibroblasti di base in PBS sterile a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Creare aliquote a 10 microliter e conservarle a quattro gradi Celsius.
Quindi impostare una nuova bottiglia non aperta da 500 millilitri di DMEM-F12 con glutammina. Aggiungere 10 millilitri di B27, cinque millilitri di N2 e cinque millilitri di penicillina-streptomicina per preparare i mezzi delle cellule staminali neurali. Posizionare 50 millilitri del supporto NSC in un tubo conico e aggiungere 10 microlitri del bFGF preparato.
Archiviare questo supporto NSC più bFGF a quattro gradi Celsius. In primo luogo, rimuovere un'aliquota di rivestimento a matrice di membrana basale congelata per piastre di coltura cellulare dal congelatore e consente di scongelare a quattro gradi Celsius. Aggiungere 385 microlitri del rivestimento a matrice di membrana basale scongelato a cinque millilitri di supporti DMEM-F12 contenenti penicillina-streptomicina.
Se le cellule vengono scongelate dalle scorte di NSC congelate, prendere una fiala di cellule congelate dal congelatore e scaldarla in un bagno d'acqua riscaldato a 37 gradi Celsius spostando il flaconcino avanti e indietro nell'acqua. Successivamente, spruzzare la fiala con il 70% di etanolo. Quindi sotto una cappa di coltura cellulare, trasferire le cellule a circa 10 millilitri di supporti DMEM-F12 contenenti penicillina-streptomicina.
Centrifuga a temperatura ambiente a 1.000 volte g per cinque minuti. Quindi aspirare il supporto e rimescolare le celle nei supporti NSC. Diluire le cellule nei supporti NSC per ottenere la densità di semina appropriata per il contenitore di coltura cellulare utilizzato.
Aggiungere abbastanza cellule sospese nei supporti NSC per seminare le stoviglie di coltura rivestite con matrice di membrana basale. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% fino a quando non sono confluenti dal 75 all'80%, assicurandosi di cambiare il supporto a giorni diversi. Per trasdurre i neuroni con il lentivirus, utilizzare un conteggio del tazzo di 340.000 unità trasducibili per cellula.
Diluire le unità trasducibili nei mezzi di coltura cellulare alla concentrazione necessaria e aggiungerle alle cellule. Due giorni dopo aver aggiunto il lentivirus, lavare le cellule una volta con mezzi freschi che non contengono bFGF. Continuare a coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% nei media senza bFGF.
Mantenere le cellule per circa otto settimane dopo la trasduzione, assicurandosi di cambiare il supporto di coltura cellulare a giorni diversi. Utilizzare un microscopio a luce per visualizzare regolarmente le cellule e garantire la vitalità. Dopo la trasduzione, rimuovere i piatti di coltura dall'incubatore assicurandosi di tenere il coperchio su di essi per mantenere la coltura ben sterile.
Utilizzare un microscopio fluorescente in grado di immagini di cellule vive per visualizzare le cellule sotto un obiettivo 10X con un'eccitazione di 514 nanometri e un filtro di emissione di 527 nanometri. In questo studio i neuroni trasdotti con tau-RDLM-YFP lentivirus sono contrassegnati fluorescentmente con YFP. Le colture trasdotto da RDLM mostrano aggregati dopo la trasduzione.
Queste inclusioni sono positive per il tioflavino. La differenziazione neuronale è confermata dall'immunoetichettatura del marcatore specifico del neurone beta-tubulina III nelle colture. È importante ricordare che gli anticorpi secondari contrassegnati fluorescentmente dovrebbero avere uno spettro di emissione di eccitazione che non si sovrapponga a quello dell'YFP.
Sebbene gli aggregati tau a fluorescenza gialla siano visibili in assenza di colorazione, la tioflavina dovrebbe essere utilizzata anche per l'imaging al fine di confermare che il segnale fluorescente è aggregato tau e non detriti cellulari. Dopo la generazione di cellule tau sovraesprimi, è possibile eseguire una serie di valutazioni della salute neuronale e dell'aggregazione tau. Ad esempio, abbiamo scoperto che queste cellule mostrano degenerazione assonale.
Oltre agli studi di coltura cellulare, abbiamo usato questo metodo per esaminare il tau di origine esosomica patogenicità.
