Abbiamo sviluppato una procedura per l'isolamento delle cellule a pennello tracheali, rare cellule epiteliali chemiosenoriali specializzate da topi reporter fluorescenti acetiltransferasi colina. Questo metodo si basa su una separazione iniziale dell'epitelio tracheale dalla sottomucosa che consente una successiva incubazione più breve del foglio epiteliale con papaina. Ciò consente un robusto recupero delle celle a pennello tracheale ed è stato utilizzato con successo per l'isolamento e l'analisi trascrizionale delle cellule pennello mediante sequenziamento dell'RNA.
La lunga incubazione con enzimi digestivi può ridurre la vitalità cellulare e alterare il profilo trascrizionale delle cellule isolate dai tessuti. Qui separiamo l'epitelio tracheale con la dispasi e successivamente lo incubamo con la papaina per un breve periodo di tempo producendo alte rese di cellule di pennello vitali. Il nostro metodo può contribuire agli studi sull'epitelio delle vie aeree superiori.
Lo stesso protocollo può essere applicato all'isolamento delle cellule pennello da altri siti mucosi come il tessuto nasale. La dimostrazione della nostra tecnica altamente riproducibile consentirà agli scienziati pari di isolare e indagare ulteriormente le cellule del pennello tracheale. Per iniziare questa procedura, aggiungere la dispasi e la DNasi I al PBS alle concentrazioni finali qui mostrate per preparare la soluzione di digestione della dispasi.
Assicurarsi che la polvere dispasi sia completamente sciolta prima di riscaldare la soluzione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Aggiungere quindi FBS inattivato al 5% a DMEM per preparare una soluzione di arresto. Per preparare il tampone Tyrode I, aggiungere papaina e L-cisteina al tampone di HEPES Tyrode senza calcio.
Per preparare il tampone Tyrode II, aggiungere la leupeptina al tampone di HEPES Tyrode senza calcio ad una concentrazione di due microlitri per millilitro. Per preparare il tampone FACS, utilizzare la soluzione di sale bilanciato di Hank senza calcio, magnesio e rosso fenolo integrata con due EDTA millimolare e 2%FBS. Dopo aver eutanasiato il mouse, utilizzare aghi calibro 21 per fissarlo su una scheda chirurgica in posizione supina con estremità superiore e inferiore estese.
Spruzzare la pelliccia con il 70% di etanolo per sanificare l'area. Usando le forcette dritte, sollevare la pelle e la pelliccia dell'addome e utilizzare forbici sezionanti per fare un'incisione al centro. Usando le forbici, separare la pelle dal tessuto sottocutaneo dall'addome alla mandibula.
Tenendo il tessuto sottocutaneo con le forcep, fare una piccola incisione con le forbici al centro della parete addominale. Quindi aprire il peritoneo con un'incisione a forma di V. Usando le forcep, spostare delicatamente l'intestino tenue di lato.
Individuare l'aorta addominale e la vena cava e fare un'incisione con le forbici dissezionanti per consentire una rapida dissanguamento. Individuare il diaframma. Usando un ago calibro 18, fai un'apertura nel diaframma appena sotto lo sterno per sgonfiare i polmoni.
Utilizzando forbici dritte affilate, tagliare lungo la base delle costole per separare accuratamente il diaframma dalla gabbia toracica. Utilizzare le forcep per sollevare l'estremità esposta dello sterno e tagliare lo sterno longitudinalmente dalla base della gabbia toracica al collo. Utilizzare forbici corte dritte per fare un'incisione cervicale centrale e separare i due lobi della ghiandola sottomandibolare.
Successivamente, utilizzare un paio di forcelle ad alta precisione a punto fine per rimuovere con cura il tessuto connettivo circostante e il timo sovrascrivono la carena. Sezionare la trachea libera separando prima l'estremità prossimale a livello dell'epiglottide e poi sezionando l'estremità distale a livello della biforcazione della trachea. Individuare l'epiglottide e tagliare la trachea longitudinalmente dall'epiglottide alla carena.
Per iniziare, posizionare la trachea in un tubo da 1,5 millilitri contenente 750 microlitri di soluzione di digestione della dispasi pre-riscaldati a 37 gradi Celsius. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per ridurre l'esposizione alla luce diretta e incubare su uno shaker a 200 giri/min e a temperatura ambiente per 40 minuti. Quindi aggiungere 750 microlitri di DMEM con 5%FBS per interrompere la reazione e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Trasferire la trachea in una piastra di Petri. Orientare la trachea con il lato epiteliale rivolto verso l'alto. La trachea sezionata longitudinalmente ha una forma semicilindrica mantenuta dagli anelli cartilaginei.
L'epitelio si trova sulla superficie concava. Utilizzando le forcette dritte, incollare l'area dell'epiglottide della trachea alla piastra di Petri e utilizzare un bisturi di smaltimento di dimensioni 22 per raschiare l'epitelio dalla trachea. Lo strato epiteliale si separerà come foglio traslucido.
Utilizzare il bisturi per tritare l'epitelio e trasferire lo strato epiteliale in un tubo da due millilitri. Risciacquare la piastra di Petri con 750 microlitri di tampone Tyrode I e trasferirlo nel tubo contenente lo strato epiteliale. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per ridurre l'esposizione alla luce diretta e incubare a 37 gradi Celsius su uno shaker a 200 giri/min per 30 minuti.
Quindi aggiungere 750 microlitri di tampone Tyrode II freddo. Vortice vigorosamente il tessuto digerito per 20-30 secondi. Utilizzando una siringa attaccata a un ago calibro 18, triturare l'omogeneato 10 volte.
Successivamente, passare a un ago calibro 21 e triturare da 10 a 20 volte in più. Filtrare le celle attraverso un colino da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere il buffer FACS freddo con un rapporto volumetrico di 30 a uno.
Centrifuga a 350 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet nel tampone FACS freddo. Trasferire questa sospensione su un tubo di polistirolo da 12 per 75 millimetri.
Centrifugare di nuovo a 350 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 100 microlitri di tampone FACS. Aggiungere quindi un microlitro di anticorpo bloccante CD1632 anti-mouse per bloccare il legame non specifico e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
Quindi aggiungere anticorpi nei rispettivi controlli isotipo come delineato nel protocollo di testo. Incubare sul ghiaccio per 45 minuti mentre è protetto dalla luce diretta. Dopo questo, aggiungere 4,5 millilitri di tampone FACS freddo e mescolare.
Centrifuga a 350 volte g e a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 300 microlitri di tampone FACS freddo. Aggiungere lo ioduro di propidio immediatamente prima dell'ordinamento citometrico del flusso.
In questo studio, le cellule a pennello tracheali dei topi reporter fluorescenti acetilcolina ChAT eGFP sono isolate con successo per il sequenziamento dell'RNA. Le cellule sono identificate dai detriti dall'angolo di dispersione avanti e laterale. I doppietti sono esclusi utilizzando l'altezza e la larghezza di dispersione in avanti e l'altezza e la larghezza della dispersione laterale.
I doppietti sono le celle con valori di larghezza elevata. All'interno delle singole cellule, le cellule vive sono identificate come la popolazione che è propidio ioduro negativo. All'interno delle singole cellule vive, le cellule da basse a negative del CD45 sono identificate in base al controllo dell'isotipo.
All'interno delle cellule negative basse CD45, le cellule positive EpCAM che sono anche eGFP positive nel canale FITC sono la popolazione di cellule pennello. I numeri delle cellule spazzolate sono alterati dall'esposizione a metaboliti microbici e protozoi e quindi riflettono la variabilità del microbiota istituzionale. Pertanto, suggeriamo di stimare il numero di celle a pennello mediante microscopia a fluorescenza per misurare il numero previsto di celle di pennello isolate mediante smistamento citometrico del flusso.
Assicurarsi di separare correttamente lo strato epiteliale della trachea in quanto determina le rese delle cellule di pennello isolate. Le celle a pennello tracheale isolate possono essere utilizzate in un'ampia gamma di saggi come il sequenziamento dell'RNA, la coltura cellulare e l'analisi funzionale.
