Questo metodo fornisce un approccio preclinica gratuito per studiare la risposta cellulare immediata al sangue nel cervello a seguito di un ictus emorragico, una condizione molto grave per la quale non abbiamo farmaci specifici disponibili per i pazienti. A differenza dei modelli di roditori, la trasparenza delle larve di zebrafish ci consente di osservare le risposte cellulari all'interno del cervello di animali vivi intatti in tempo reale utilizzando la microscopia fluorescente. Per iniziare, utilizzare un colino da tè per raccogliere tutti gli embrioni fecondati dalla deposizione delle uova naturali nelle scatole di riproduzione prodotte da un maschio e da una a due femmine di zebrafish adulti.
Trasferire 100 embrioni in ogni piastra di Petri contenente il mezzo embrione standard E3. Incubare a 28 gradi Celsius e fase secondo le linee guida standard. A sei ore dopo la fecondazione, rimuovere embrioni morti e non fecondati dal piatto usando una pipetta Pasteur e rimettere i piatti nell'incubatrice.
A 24 ore dopo la fecondazione, sotto un microscopio stereo a campo brillante, utilizzare forcep di dissezione ultra sottile affilati per decorionare gli embrioni per il trattamento con atorvastatina. Quindi aggiungere 30 millilitri di embrione E3 medio a due piastre di Petri pulite, una per il trattamento e l'altra per il controllo. Rimuovere 60 microlitri di acqua embrionale dal piatto di trattamento e aggiungere 60 microlitri di 0,5 millimolare Atorvastatina per ottenere l'80% delle larve emorragie.
Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire 100 embrioni nella massima acqua possibile ad ogni piatto. Incubare i due piatti a 28 gradi Celsius. In qualsiasi momento dopo 50 ore dopo la fecondazione, al microscopio utilizzare una pipetta Pasteur per separare accuratamente il pesce emorragico dalle popolazioni non emorragiche e trasferire le larve a nuovi piatti contenenti mezzi E3 freschi.
Per rendere più facile separare le larve positive all'emorragia, è possibile utilizzare pesci senza pigmento o pesci che esprimono proteine fluorescenti nei globuli rossi. Il terzo giorno, sotto uno schermo al microscopio fluorescente le larve per garantire l'espressione di proteine fluorescenti. Quindi riempire la camera di montaggio della lastra luminosa con supporti E3 contenenti lo 0,2%MS-222 per l'anestesia.
Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire una singola goccia contenente da una a sei larve su una superficie asciutta della piastra di Petri per il montaggio. Utilizzare una pipetta per rimuovere il più liquido possibile. Aggiungere una goccia di agarosio a bassa fusione dell'1,5% dal blocco termico di 45 gradi Celsius alle larve e utilizzare un capillare di montaggio di 800 micrometri per disegnare prima le larve sulla testa.
Se il posizionamento non è accurato, espellere le larve dall'agarosio e montare di nuovo. Lasciare raffreddare il capillare e quindi inserirlo nella camera del foglio luminoso. Sul software di imaging ZEN, premere continuo per orientare le larve e premere acquisire per acquisire immagini z-stack della testa tra le lenti oculari.
Nella scheda di elaborazione generare un'immagine di proiezione di intensità massima da ogni z-stack. Per selezionare casualmente per il test di motilità, trasferire 24 larve dopo l'anestesia in mezzi E3 freschi e consentire agli animali di riprendersi dall'anestesia. Dopo che le larve si sono completamente riprese dall'anestesia, utilizzando una pipetta con il trasferimento del taglio finale larve recuperate nel mezzo E3 senza blu metilene.
Placcare una larva in un millilitro per pozzo di un piatto di 24 pozzetto. Caricare la piastra nella camera della fotocamera. Nel software di tracciamento EthoVision XT, regola le impostazioni dell'esperimento per impostare una routine di startle a luce bianca per aumentare il nuoto spontaneo e il movimento del test per 10 minuti.
Ripetere il saggio di locomozione a 96 e 120 ore dopo la fecondazione. La valutazione della morte delle cellule cerebrali utilizzando un'ubiquitina transgenica secreta annexin V M venous reporter line si traduce in chiari ammassi definiti di cellule morenti in larve emorragiche che sono assenti in tutte le larve non emorragiche indicate da fluorescenza verde Le immagini a campo luminoso dimostrano la presenza di sanguinamenti cerebrali. Le cellule morenti sono state osservate sia nei modelli di Atorvastatina che in quello della testa di bolla per le larve emorragiche.
La morfologia dei macrofagi positivi MPEG1 cambia nelle larve positive dell'emorragia intracerebrale mentre le cellule adottano in forma ameboide arrotondata attiva. Queste cellule arrotondate attivate sono state monitorate nel tempo per mostrare una maggiore risposta fagocitica dell'ubiquitina secreta Annexin V M venous che esprime cellule morenti in larve positive di emorragia intracerebrale. L'emorragia cerebrale è associata a una significativa diminuzione della motilità a 72 e 96 ore dopo la fecondazione rispetto ai controlli dei fratelli negativi dell'emorragia intracerebrale.
La motilità a 120 ore dopo la fecondazione si riprende vicino ai livelli di base. L'aspetto più importante di questa procedura è assicurarsi di esaminare a fondo le larve per la presenza o l'assenza di emorragie cerebrali prima di procedere ai test di fenotipizzazione. Questo modello può anche essere utilizzato per lo screening farmacologico per determinare se la gravità del fenotipo può essere migliorata dopo una sanguine, un approccio che potrebbe portarci a identificare nuovi candidati alla droga in futuro.
Questa tecnica ci permette di esplorare le risposte cellulari immediatamente dopo un'emorragia cerebrale durante un momento che è stato così notoriamente difficile da studiare prima d'ora. Sebbene nessuno dei reagenti o degli strumenti descritti in questo protocollo sia specificamente pericoloso, le cure e le precauzioni standard devono essere prese ogni volta che si utilizzano sostanze chimiche, taglienti o laser.
