Qui abbiamo applicato la microiniezione di RNA etichettati fluorescentmente per rilevare sequenze di RNA che sono essenziali per la localizzazione di brevi RNA nucleari in strutture nucleari chiamate corpi di Cajal. Questa tecnica ha due vantaggi principali. In primo luogo, può essere applicato per gli RNA brevi che sono altrimenti difficili da etichettare e tracciare.
E in secondo luogo, permette uno screening rapido di diverse sequenze e testa il loro ruolo nella localizzazione dell'RNA. Un giorno prima della microiniezione, seminare HeLa o altre cellule aderenti su coverlips da 12 millimetri per raggiungere il 50% di confluenza al momento della microiniezione. Per iniziare, posizionare un coverslip preparato al centro di una piastra di Petri, aggiungere celle e due millimetri di mezzi di coltura.
Il giorno seguente, posizionare la piastra di Petri riempita di cella su uno stadio di microscopio. Utilizzando un microloader, caricare tre microlitri della miscela di snRNA nell'ago e installare l'ago nel supporto del microiniettore con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie della piastra di Petri. Usa un obiettivo a lunga distanza 10 volte per trovare l'ago.
In primo luogo, impostare la velocità grossolana sull'iniettore e abbassare l'ago fino a tocchi il mezzo di coltura. Usando il binocolo del microscopio, trova il punto luminoso che è il luogo in cui l'ago tocca il mezzo di coltura. Cambiare la velocità per multare e abbassare ulteriormente l'ago mentre si guarda al microscopio fino a quando non si osserva la punta dell'ago.
Spostare l'ago al centro del campo visivo e passare a un obiettivo a lunga distanza 40X. Successivamente, selezionare la cella e spostare l'ago sopra la cella. Impostare la pressione e il tempo per il contatto cellulare.
Spostare l'ago verso il basso nella cella e quindi impostare il limite inferiore del micromanipolatore. L'impostazione del limite inferiore è la parte più critica del protocollo. Poiché la superficie del coverslip non è perfetta e poiché ogni cella è diversa, dovrai impostare il limite inferiore più volte durante la sessione di iniezione.
Quindi, spostare l'ago sopra la cella e premere il pulsante di iniezione sul joystick dell'iniettore. L'ago si muoverà automaticamente all'interno della cella nel punto in cui è impostato il limite per iniettare la miscela di RNA. Per finire, premere il pulsante del menu sull'iniettore e rimuovere l'ago dal supporto.
Quindi scollegare il tubo dall'iniettore prima di spegnere l'iniettore e il micromanipolatore. Dopo la microiniezione, riportare le cellule in un incubatore di anidride carbonica e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, sciacquare le cellule tre volte con PBS a temperatura ambiente.
Fissare le celle per 20 minuti con paraformaldeide al 4% in 0,1 tubi molari a pH 6,9. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS a temperatura ambiente. Se viene analizzata solo la localizzazione dello snRNA, sciacquare brevemente le cellule in acqua e montarlo in un mezzo di montaggio con DAPI.
In caso di localizzazione proteica aggiuntiva, permeabilizzare le cellule con 0,5%Triton X-100 in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Risciacquare le cellule tre volte con PBS e macchiarle con gli anticorpi primari e secondari appropriati come delineato nel protocollo di testo. Quindi risciacquare tre volte con PBS e risciacquare una volta in acqua.
Successivamente, montare le celle in un supporto di montaggio con DAPI. Quando sei pronto per l'immagine, utilizza un sistema microscopico a fluorescenza di fascia alta dotato di un obiettivo di immersione per acquisire le immagini. Una volta identificate le cellule microiniettate, raccogliere una pila di sezioni 20 Z con passaggi Z di 200 nanometri per campione e soggette a deconvoluzione matematica.
Per quantificare il segnale fluorescente, aprire prima l'immagine della microscopia in ImageJ e dividere i canali in finestre. Sincronizzare le finestre con lo strumento sincronizza finestra. Successivamente, disegna la regione di interesse attorno a un corpo di Cajal identificato dall'immunosocienza della coilina.
Misurare l'intensità del segnale snRNA nel ROI definito dalla coilina. Determinare l'intensità della fluorescenza dello snRNA nel ROI posta casualmente nel nucleoplasma. Salvare i valori misurati e calcolare il rapporto tra il segnale di RNA nel corpo di Cajal e il nucleoplasma.
In questo studio, gli snRNA etichettati fluorescentmente vengono microiniettati per monitorarne il trasporto all'interno della cellula. Per verificare se il sito SM è importante per l'accumulo del corpo di Cajal, lo snRNA privo del sito SM viene microiniettato direttamente nel nucleo. L'iniezione nel citoplasma funge da controllo mentre lo snRNA a tutta lunghezza viene microiniettato per servire come controllo positivo.
Dopo l'incubazione, le cellule microiniettate vengono fissate e la coilina del marcatore corporeo cajal viene visualizzato dall'immunofluorescenza indiretta. Lo snRNA a tutta lunghezza si è accumulato nei corpi di Cajal dopo iniezioni nucleari e citoplasmatici. Al contrario, lo snRNA privo del sito SM è rimasto nel citoplasma dopo la microiniezione in questo compartimento mentre la microiniezione nucleare di snRNA senza il sito SM rivela che la sequenza di legame SM è importante per la localizzazione del corpo di Cajal in quanto questo snRNA rimane nel nucleo ma non si accumula nei corpi di Cajal.
A volte la microiniezione in un solo compartimento cellulare fallisce e il Dextran 70 kilodalton ingannato può essere trovato sia nel nucleo che nel citoplasma. Queste cellule vengono scartate da ulteriori analisi. Nonostante il fatto che gli snRNA etichettati fluorescentmente siano conservati a -80 gradi Celsius prima dell'iniezione, può verificarsi la degradazione dell'RNA.
Lo snRNA degradato iniettato nel citoplasma non viene trasportato nel nucleo e rimane localizzato nel citoplasma. Tale snRNA deve essere scartato e il nuovo snRNA deve essere sintetizzato. È importante regolare correttamente le pressioni di iniezione e compensazione per il tipo di cella.
E come detto prima, impostare il limite inferiore corretto per l'iniezione cellulare è essenziale per una buona microiniezione. Si prega di ricordare che il fenolo-cloroformio utilizzato durante l'isolamento dell'RNA è pericoloso e che l'ago di microiniezione è un oggetto appuntito. Fare attenzione quando si maneggiano questi materiali.
