Le piastrine dovrebbero essere libere da cellule del sangue e proteine quando studiano le loro proprietà biochimiche e fisiologiche. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo per purificare le piastrine dal sangue del topo. Questa tecnica può purificare le piastrine usando la centrifugazione a media e bassa velocità del gradiente di ioesolo, con conseguente chiara separazione delle piastrine dagli altri componenti del sangue.
Per purificare le piastrine, utilizzare una punta di pipetta a foro largo per strato 200 microlitri di sangue intero appena raccolto lentamente lungo il lato di un tubo da 1,5 millilitri su 600 microlitri di mezzo gradiente di ioesolo senza miscelazione. Dopo la centrifugazione in un rotore a secchio oscillante per isolare le piastrine, utilizzare una nuova punta di pipetta a foro largo per raccogliere la maggior parte dello strato ricco di piastrine e una piccola frazione dello strato povero di piastrine senza aspirare il globulo bianco o lo strato di globuli rossi. Aggiungere il campione piastrinica a un nuovo tubo e aggiungere un millilitro di PBS alle piastrine.
Mescolare le piastrine per inversione prima di eseguire un'altra centrifugazione. Quindi rimospendare il pellet in 200 microlitri di PBS con pipettazione delicata. Per l'attivazione piastrinica, trasferire da uno a due volte 10 alle sei piastrine in un nuovo tubo contenente 100 microlitri di tampone di colorazione.
Aggiungere da uno a due per 10 alle sei piastrine a un tubo diverso contenente 100 microlitri di tampone di colorazione integrati con peptide GPRP da 0,4 millimolare. Aggiungere la trombina al tubo con il peptide GPRP per attivare le piastrine e aggiungere il cocktail anticorpale di interesse per entrambi i tubi. Come controllo positivo, aggiungere un microlitro di sangue intero in un massimo di 100 microlitri di tampone di colorazione in un tubo contenente peptide GPRP da 0,4 millimolare e aggiungere trombina per attivare queste piastrine.
Come controllo negativo, aggiungere un microlitro di sangue intero in un massimo di 100 microlitri di tampone di colorazione. Quindi macchia entrambi i tubi di controllo con il cocktail di anticorpi. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente al buio, lavare i campioni con un millilitro di tampone di colorazione fresco per tubo.
Rimosogliere il pellet in 300 microlitri di tampone di colorazione fresco. Quindi trasferire i campioni di cellule in singoli tubi di analisi della citometria a flusso protetti dalla luce. Per analizzare le piastrine per citometria di flusso, create un nuovo esperimento e generate grafici a punti di dispersione laterale logaritmica in avanti rispetto ai grafici a punti di dispersione laterale logaritmica.
Dopo aver regolato le tensioni in base alle esigenze, registrare le celle macchiate a colori singoli per i controlli di compensazione. Ora esegui il campione di controllo positivo per acquisire abbastanza celle per regolare la compensazione e i cancelli. Quindi acquisire e registrare 100.000 eventi per ogni campione di sangue intero e analizzare i dati della citometria del flusso utilizzando i grafici e i cancelli appropriati.
Se il sangue viene aggiunto lentamente al mezzo, il mezzo gradiente di ioesolo e il campione di sangue formeranno due strati separati nel tubo. Dopo la centrifugazione, lo strato superiore color paglia contiene il plasma ma nessuna cellula sanguigna intatta. Il secondo strato, biancastro, ricco di piastrine contiene la maggior parte delle piastrine.
Il terzo strato trasparente è lo strato povero di piastrine ed è direttamente sopra i globuli rossi e il pellet di globuli bianchi. Il sangue intero mostra popolazioni distinte di globuli rossi, globuli bianchi e piastrine su una trama di punti di dispersione logaritmica in avanti rispetto alla dispersione laterale. Le piastrine purificate, tuttavia, dimostrano una popolazione distinta con un numero trascurabile di globuli rossi o bianchi.
Campioni di sangue intero contengono globuli rossi positivi a Ter119 e popolazioni di globuli bianchi positivi al CD45 che sono quasi assenti nei campioni di piastrine purificate. Le piastrine purificate non trattate non esprimono quasi nessun marcatore di attivazione che ne confermi lo stato di riposo, mentre le piastrine trattate con trombina purificata in genere dimostrano un'espressione di 71%P-selectin. La valutazione microscopica di campioni di piastrine purificate non trattate non rivela alcuna aggregazione piastrinica.
Dopo l'attivazione con trombina, tuttavia, le piastrine dimostrano una robusta aggregazione, confermando ulteriormente la loro vitalità dopo la purificazione come dimostrato. Sovrapporre attentamente il campione di sangue sul mezzo di ioesolo e, quando si raccolgono le piastrine, assicurarsi di aspirare con attenzione per non raccogliere i globuli rossi e gli strati di globuli bianchi per una corretta purificazione piastrinica. Questo metodo può essere utilizzato anche per la purificazione piastrinica di altre specie.
Le piastrine purificate possono essere utilizzate per l'espressione genica, l'attivazione, l'aggregazione, il rilascio di granuli e gli studi di adesione.
