혈소판은 생화학적 및 생리적 특성을 연구 할 때 혈액 세포와 단백질에서 자유로이어야합니다. 따라서, 우리는 마우스 혈액에서 혈소판을 정화하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 기술은 요오헥솔 그라데이션 배지 및 저속 원심분리를 사용하여 혈소판을 정화하여 다른 혈액 성분으로부터 혈소판이 명확하게 분리될 수 있습니다.
혈소판을 정화하려면 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 새로 수확한 전혈 200 마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브 의 측면 아래로 천천히 혼합하지 않고 600 마이크로리터의 요오헥솔 그라데이션 배지에 겹쳐 놓습니다. 혈소판을 분리하는 스윙 버킷 로터에서 원심분리 후, 새로운 와이드 보어 파이펫 팁을 사용하여 혈소판이 풍부한 층과 혈소판 가난한 층의 작은 부분을 백색 혈전 이나 적혈구 층을 심궁하지 않고 수집합니다. 혈소판 샘플을 새 튜브에 추가하고 혈소판에 PBS 1 밀리리터를 추가합니다.
다른 원심 분리를 수행하기 전에 반전으로 혈소판을 혼합합니다. 그런 다음 온화한 파이펫팅으로 PBS의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 혈소판 활성화를 위해, 염색 완충제의 100 마이크로리터를 포함하는 새로운 관에 6개의 혈소판에 1-2 번 10을 전송합니다.
0.4 밀리머 GPRP 펩타이드로 보충된 염색 완충제 100 마이크로리터를 함유한 다른 튜브에 1-2회 10회 10회 첨가한다. 혈소판을 활성화하기 위해 GPRP 펩타이드와 튜브에 혈소판을 추가하고 두 튜브모두에 관심있는 항체 칵테일을 추가합니다. 양성 대조군으로서, 0.4 밀리머 GPRP 펩티드를 함유한 튜브에 염색 완충제의 최대 100마이크로리터에 전혈의 마이크로리터 1개를 추가하고, 이러한 혈소판을 활성화하기 위해 혈전을 추가한다.
부정적인 대조군으로서 염색 버퍼의 최대 100 마이크로 리터에 전혈 의 마이크로 리터 1 개를 추가하십시오. 그런 다음 항체 칵테일로 두 제어 튜브를 얼룩지게합니다. 어둠 속에서 실온에서 30 분 후, 튜브 당 신선한 염색 버퍼의 1 밀리리터와 샘플을 씻어.
신선한 염색 버퍼의 300 마이크로 리터에 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음 세포 샘플을 빛으로부터 보호된 개별 유동 세포 분석 튜브로 옮기합니다. 혈소판을 유동 세포측정에 의해 분석하려면, 새로운 실험을 생성하고, 로개스믹 측 산란 점 플롯대 로개스믹 전방 산란을 생성한다.
필요에 따라 전압을 조정한 후 보정 컨트롤에 대해 단일 색상 염색 셀을 기록합니다. 이제 양수 제어 샘플을 실행하여 보정 및 게이트를 조정할 수 있는 충분한 셀을 획득합니다. 그런 다음 각 혈액 샘플에 대해 100, 000 개의 이벤트를 획득하고 기록하고 적절한 플롯및 게이트를 사용하여 유동 세포 측정 데이터를 분석합니다.
혈액이 배지에 천천히 첨가되면 요오헥솔 그라데이션 배지와 혈액 샘플은 튜브내의 두 개의 분리된 층을 형성합니다. 원심 분리 후, 상단, 짚 색 층은 플라즈마를 포함하지만 그대로 혈액 세포가 없습니다. 두 번째, 희끄무레, 혈소판이 풍부한 층은 혈소판의 대부분을 포함.
세 번째, 투명 층은 혈소판 이 가난한 층이며 적혈구와 백혈구 펠릿 바로 위에 있습니다. 전혈은 적혈구, 백혈구 및 혈소판의 뚜렷한 인구를 나타내며, 측면 산란점 플롯대 로그산구 앞으로 산란시한다. 정제 된 혈소판은, 그러나, 적혈구 또는 백혈구의 무시할 수 있는 수로 명백한 인구를 보여줍니다.
전혈 샘플에는 정제 된 혈소판 샘플에서 거의 결석한 Ter119 양성 적혈구 및 CD45 양성 백혈구 인구가 포함되어 있습니다. 처리되지 않은 정제 혈소판은 그들의 휴식 상태를 확인하는 거의 어떤 활성화 마커를 표현하지 않는 반면, 정제된 혈소판처리된 혈소판은 전형적으로 71%P-selectin 발현을 나타낸다. 처리되지 않은 정제 혈소판 샘플의 현미경 평가는 혈소판 응집없음을 드러내지 않습니다.
혈소판은 혈소판으로 활성화된 후, 강력한 응집력을 보여 주며, 입증된 대로 정화 후의 생존가능성을 더욱 확인한다. 혈액 샘플을 요헥솔 배지에 조심스럽게 겹쳐 놓고 혈소판을 수집할 때는 성공적인 혈소판 정화를 위해 적혈구및 백혈구 층을 수집하지 않도록 주의 깊게 흡인해야 한다. 이 방법은 다른 종으로부터의 혈소판 정화에도 사용될 수 있다.
정제 된 혈소판은 유전자 발현, 활성화, 응집, 과립 방출 및 접착 연구에 사용될 수 있습니다.
